紅菜薹細胞質(zhì)雄性不育系的農(nóng)藝性狀調(diào)查及POD同工酶分析

邵明珠徐躍進萬正杰鄧霜

（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，華中農(nóng)業(yè)大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

國內(nèi)外對十字花科中的甘藍型油菜雄性不育的研究和利用較為廣泛（Shiga ＆ Baba，1973；劉忠松和官春云，1990；Wang et al.，2000）。王亞馥等（1984）比較研究了大白菜雄性不育兩用系可育株和不育株花苞的過氧化物同工酶，結(jié)果表明不育株的過氧化物酶活性高于可育株，而且譜帶多。梁燕等（1994）以大白菜為試材，進行過氧化物同工酶研究，也得到了與王亞馥（1984）相似的結(jié)論。許忠明等（2004）以甘藍胞質(zhì)雄性不育系及其保持系為試材，分析了POD同工酶的譜帶差異。結(jié)果表明，不育系和保持系間POD同工酶差異以花、大蕾和小蕾最大，葉和根間差異不明顯。在花和花蕾中，不育系酶帶活性強于相應的保持系，在根中正好相反。但關于紅菜薹〔Brassica campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makino var.utilisTsen et Lee〕胞質(zhì)雄性不育系和保持系不同組織器官POD同工酶的變化規(guī)律以及POD同工酶與紅菜薹胞質(zhì)雄性不育的關系目前鮮有報道。

本試驗利用新型甘藍型油菜雄性不育材料（EruCMS）細胞質(zhì)雄性不育系與紅菜薹保持系俞優(yōu)雜交后，再經(jīng)過連續(xù)的多代回交，獲得了紅菜薹異源細胞質(zhì)雄性不育系材料，其不育率100%，低溫不黃化，蜜腺正常，同時以紅菜薹保持系俞優(yōu)為材料研究不同器官的POD同工酶的變化，探討紅菜薹細胞質(zhì)雄性不育形成的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

新型甘藍型油菜雄性不育材料（EruCMS）細胞質(zhì)雄性不育系（用油菜P系表示）與紅菜薹保持系俞優(yōu)（用紅菜薹B系表示）雜交后，再經(jīng)過連續(xù)的多代回交，獲得了紅菜薹異源細胞質(zhì)雄性不育系材料（用紅菜薹A系表示）。

1.2 方法

1.2.1 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系的形態(tài)觀測 試驗于2010年在華中農(nóng)業(yè)大學蔬菜實習基地大棚進行，試材于9月25日定植于大棚，常規(guī)田間管理。10月24日用卷尺和游標卡尺測定油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系3種試材葉片生長期植株的株高、開展度、葉柄的長和粗、最大葉片的長和寬等形態(tài)特征；11月25日測定3種試材的花朵開展度、花瓣的長和寬、花柱長、雄蕊長、花絲長等性狀，每種試材測10株，3次重復，然后對3種試材花器官拍照并采用TTC法（王學奎，2006）測定其花粉活力。

1.2.2 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系的POD同工酶分析 在不育系和保持系群體中隨機取樣，分別取其葉片、葉柄、薹、花蕾（大蕾≥3.5 mm，中蕾2～3 mm，小蕾＜1 mm）和當日開放的花為試樣。電泳采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，配方參考郭堯君（1999）的方法，同工酶染色方法采用聯(lián)苯胺染色法（許忠民 等，2004）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系外部形態(tài)和特性的比較

3種試材的花器官外部形態(tài)和特性見圖1，油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系花器官外部特征基本相同，自外向內(nèi)分別由4枚萼片、4枚花瓣排成十字型，雄蕊6枚，四強雄蕊，外輪2枚較短，內(nèi)輪4枚較長（圖1-P1、A1、B1）；紅菜薹B系的花藥基本和柱頭等高，雄蕊有花粉，有利于正常的授粉結(jié)實（圖1-B2、B3）。油菜P系花藥直立，緊貼柱頭，但遠遠低于柱頭（圖1-P2、P3），而紅菜薹A系的花藥向四周伸展，但二者蜜腺都正常，雌蕊都能正常的授粉結(jié)實，而且不受溫度的影響，不育度和不育率達100%（圖1-A2、A3）。

2.2 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系農(nóng)藝性狀的調(diào)查分析

通過對油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系在生長期的形態(tài)指標和花器官性狀作比較得出（表1）：紅菜薹B系生長期的最大葉片寬顯著大于油菜P系和紅菜薹A系，而最大葉片長三者之間差異不顯著；從三者的株高上看，油菜P系的最高，紅菜薹A系次之，而紅菜薹B系最矮；紅菜薹A系與油菜P系的葉柄長和粗達到了顯著差異水平；植株開展度三者之間沒有顯著差異。

圖1 油菜P系、紅菜薹B系與紅菜薹A系的花器官外部形態(tài)和特性

油菜 P系、紅菜薹 A系和紅菜薹 B系在花器官性狀方面存在差異，有的甚至達到了顯著或極顯著水平。在花朵的開展度方面，三者間紅菜薹 A系的最小，而油菜 P系、紅菜薹B系之間沒有顯著差異；在花瓣大小方面，紅菜薹A系的花瓣長和寬最小，與油菜 P系、紅菜薹 B系之間存在極顯著差異；油菜 P系的花柱最長，比紅菜薹 A系和紅菜薹B系材料高出19%、18%，而紅菜薹 A系和紅菜薹 B系的花柱長沒有顯著差異；但在雄蕊長、花絲長以及雌雄蕊高度差等方面油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系均達到了極顯著差異，且紅菜薹 A系居于二者之間，中和了父母本性狀，充分體現(xiàn)了雜種優(yōu)勢。

2.3 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系的花粉活力分析

從2010年11月～2011年3月上旬連續(xù)對油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系的花粉進行活力檢測。紅菜薹B系的花粉被TTC染成了紅色（圖2-B），說明花粉具有活力；油菜P系（圖2-P）和紅菜薹A系（圖2-A）的花粉被染成淺黃色，說明花粉無活力，紅菜薹A系育性很穩(wěn)定。

表1 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系農(nóng)藝性狀的調(diào)查分析結(jié)果 cm

圖2 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系的花粉活力（×10倍）

2.4 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系的POD同工酶分析

油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系材料從葉片、葉柄、薹3個部位的POD同工酶酶譜來看（圖3、4）：負極到正極出現(xiàn)了1～5條譜帶，其中Rf=0.409是一條共有譜帶；紅菜薹B系和油菜P系葉片的譜帶比紅菜薹A系多，油菜P系特有Rf=0.606和0.682的譜帶，而紅菜薹B系特有Rf=0.227的譜帶；紅菜薹A系和紅菜薹B系葉柄的譜帶基本沒區(qū)別，與油菜P系僅有一條共有譜帶；在薹中從負極到正極，POD同工酶的譜帶有3條或5條，紅菜薹A系比紅菜薹B系少兩條弱譜帶（Rf=0.272和0.788）。

圖3 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系葉片POD同工酶酶譜和模式圖

圖4 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系葉柄和薹POD同工酶酶譜和模式圖

從油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系材料花和不同級別花蕾4種試樣POD同工酶酶譜可以看出（圖5）：由負極到正極出現(xiàn)了1～4條譜帶，Rf=0.446是一條共有譜帶，但不同類型試材和同一試材不同器官間酶譜帶存在強弱差異性，說明此條帶在表達上具有很強的階段性；三者花（P4、A4、B4）中具有相同的POD同工酶譜帶，而不同級別的蕾中POD同工酶譜帶存在差異；在油菜P系的小蕾（P7）中比其他試材（A7、B7）多兩條弱譜帶，紅菜薹A系的中蕾（A6）比其他兩份材料（P6、B6）多一條Rf=0.257的譜帶，是其特有的一條弱的譜帶，有可能與其不育相關。

圖5 油菜P系、紅菜薹B系和紅菜薹A系盛花期POD同工酶酶譜差異表現(xiàn)

由3類試材的POD同工酶酶譜比較可以看出，油菜P系、紅菜薹A系在葉片、葉柄及蕾的POD同工酶酶譜差異較大，而紅菜薹A系和紅菜薹B系在葉柄中的POD同工酶酶譜沒有區(qū)別，而在葉片、薹及蕾中有明顯差別，特別是紅菜薹A系和紅菜薹B系蕾由小到大，同工酶POD譜帶上則表現(xiàn)出由少到多，譜帶強弱差異較大。從花藥到小孢子的發(fā)育階段來看，可能是花粉敗育之前，物質(zhì)合成代謝旺盛，POD活性相對較弱?；ǚ坶_始敗育后，物質(zhì)分解代謝加強，POD同工酶譜帶上則表現(xiàn)出譜帶多，染色深。

3 結(jié)論與討論

3.1 紅菜薹異源胞質(zhì)雄性不育系（紅菜薹A系）、紅菜薹自交系（紅菜薹B系）與新型甘藍型油菜雄性不育材料（Eru CMS）（油菜P系）不育系農(nóng)藝性狀調(diào)查分析

植物性狀表現(xiàn)主要由遺傳基因決定，試驗的觀察結(jié)果表明，油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系3類供試材料在花器官的形態(tài)上7個主要性狀之間都存在顯著差異，其中在雄蕊長、花絲長、雌雄蕊的高度差方面，三者差異規(guī)律性變化是紅菜薹A系居中，在花柱性狀方面紅菜薹A系和紅菜薹B系沒有區(qū)別，油菜P系最大；而在花瓣的長和寬方面，油菜P系最大、紅菜薹B系居中、紅菜薹A系最小。生長期的植物學性狀調(diào)查顯示，差異性不顯著，沒有規(guī)律性可尋。分析原因可能是由于這些性狀多為數(shù)量基因決定的性狀遺傳，紅菜薹A系材料是紅菜薹B系與油菜 P系的雜交后代，通過多代回交核基因未純合之前仍處于中間型，因而表現(xiàn)出花器大小居中的特性。由此結(jié)果也說明紅菜薹自交系轉(zhuǎn)育新型甘藍型油菜雄性不育材料（EruCMS）基因通過雜交和回交是可行的，紅菜薹的核基因在其回交后代中是能夠表現(xiàn)的。

從2010年11月～2011年3月上旬連續(xù)對BC6的花粉進行活力檢測，這期間武漢經(jīng)歷了多次寒流的襲擊，氣溫變化劇烈，但均未觀察到可育花粉粒，說明 BC6的不育性很穩(wěn)定。說明轉(zhuǎn)育是可行的，可以對其配制雜交組合，進行配合力的測定。

3.2 紅菜薹A系、紅菜薹B系與油菜P系的POD同工酶分析

對于POD同工酶與雄性不育的關系，一種觀點認為雄性不育與花藥（或整個生殖器官）中的膜脂過氧化作用密切相關，膜脂過氧化受體內(nèi)的活性氧含量的直接影響，而過氧化物酶對清除活性氧有重要作用。但一般認為過氧化物酶同工酶基因是在雄性不育發(fā)生過程中被動開啟的，即過氧化物酶同工酶活性高的時候就是活性氧含量高的時候，也就是說在幼蕾期正在發(fā)生著強烈的膜脂過氧化作用，進而引起了一系列敗育過程，導致雄性不育的發(fā)生（任雪松 等，2004）。

本試驗油菜P系、紅菜薹A系和紅菜薹B系3類供試材料的在各個器官當中的POD同工酶分析顯示，紅菜薹A系和紅菜薹B系間的差異主要發(fā)生在生殖生長時期，在抽薹期，紅菜薹A系的薹比紅菜薹B系的薹少了兩條譜帶（Rf=0.272和Rf=0.788）；在特定的蕾期差異比較明顯，而且紅菜薹A系比紅菜薹B系在中蕾中多了1條譜帶（Rf=0.257），這與梁燕等（1994）、張麗等（2006）及趙會芳等（2009）的研究結(jié)果一致，與劉忠松和官春云（1990）的研究結(jié)果相反。劉忠松和官春云（1990）研究指出：開花期花蕾中，不育系較保持系的過氧化物酶譜帶少、酶活性弱，隨著花蕾的發(fā)育，保持系增加了1條譜帶，且酶活性亦有增加趨勢。由于甘藍型油菜、蘿卜、大白菜和甘藍均為十字花科的作物，有一定的可比性?？梢?，這些細胞質(zhì)雄性不育的過氧化物酶同工酶在生殖器官（花蕾）中存在差異這一點上是一致的，但具體差異的形式和程度卻因植物而異。

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