38株多重耐藥鮑曼不動桿菌超廣譜酶基因的研究Δ

郭雷靜，李鑫，張淑芹，陸思靜#（.遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州00；.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 00）

不動桿菌是常見的革蘭陰性桿菌之一，為重要的條件致病菌。近年來不動桿菌臨床標本分離率和耐藥率逐漸升高，其中最受關(guān)注的是鮑曼不動桿菌。2009年CHINET[1]數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素特別是頭孢菌素類耐藥率均超過50%，分離率占革蘭陰性桿菌第4位；而北京協(xié)和醫(yī)院[2]鮑曼不動桿菌則超過銅綠假單胞菌上升到第2位，僅次于大腸埃希菌，對頭孢菌素類耐藥率均超過70%。我院2010年共檢測出鮑曼不動桿菌62株，其中多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）為38株，占61.29%。目前國內(nèi)、外多項研究表明，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）機制是細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥最重要的原因之一。為了解我院MDRAB攜帶耐藥基因狀況，筆者對38株MDRAB進行了超廣譜酶基因檢測，為探討細菌耐藥機制及指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2010年遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院住院患者臨床標本不動桿菌共62株，篩選出MDRAB共38株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離株。38株MDRAB中，痰液17份，導(dǎo)管痰10份，分泌物3份，胸水、尿液及膿液各2份，血液、腦脊液各1份。

1.2 主要試劑與儀器

MicroScan WalkAway 40全自動微生物鑒定系統(tǒng)及其配套的鑒定藥敏復(fù)合板（美國Dade公司生產(chǎn)）；100 bp ladder DNA marker、瓊脂糖純化試劑盒、dNTP及Taq DNA聚合酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司生產(chǎn)；DNA Thermal Cycler 2400為美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

1.3 藥敏試驗方法

采用微量稀釋法測定細菌對抗菌藥物的敏感性，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2007年版要求進行抗生素敏感性判斷，用WHONET 5.4軟件分析結(jié)果。抗菌藥物品種分別為頭孢吡肟（FEP）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、氨芐西林/舒巴坦（SAM）、哌拉西林（PIP）、替卡西林/克拉維酸（TCC）、復(fù)方磺胺甲唑（SXT）、環(huán)丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LVX）、亞胺培南（IPM）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、阿米卡星（KAN）。標準質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 超廣譜酶基因的PCR檢測及DNA測序分析

從LB培養(yǎng)基上挑取單個受試菌落加入5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r·min－1震蕩孵育16～20 h。取1.5 mL菌液12 000 r·min－1離心5 min，棄去上清，加入80 μL蒸餾水混勻，95 ℃加熱10 min后12 000 r·min－1離心5 min，取上清2 μL作ESBLs基因檢測的模板。

引物序列出處及反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物長度Tab 1 Sequence of PCR primer and the length of products

PCR擴增體系均為25 μL，每個體系中包含：（1）10×loading buffer 2.5 μL；（2）20μmol·L－1的引物各 0.5 μL；（3）1.25 U的 TaqDNA 聚合酶；（4）模板 2 μL；（5）濃度為 10 μmol·L－1dNTP各 0.5 μL，最后加滅菌去離子水至25 μL。

在紫外燈下觀察擴增PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中的分析結(jié)果，出現(xiàn)明亮目的條帶者為陽性。陽性條帶行切膠純化后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，登陸GenBank用Blast程序分析、比對。

2 結(jié)果

2.1 科室分布

MDRAB在重癥監(jiān)護室（ICU）檢出率最高，其次為呼吸科和神經(jīng)外科，感染部位以呼吸道和手術(shù)切口為最高，分別為67.5%和17.5%。該菌在不同科室的分布見表2。

表2 38株MDRAB分布株數(shù)和百分率Tab 2 Number and percentage of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

圖1 TEM基因PCR結(jié)果電泳圖M.100 bp ladder DNAmarker；N.陰性對照；1～6.WSW01～06Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of TEMM.100 bp ladder DNAmarker；N.negative control；1～6.WSW01～06

圖2 PER-1基因和SHV基因PCR電泳圖M.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38Fig 2 Electrophoretogram of PCR product of PER-1 and SHVM.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38

2.2 對14種抗生素耐藥性

38株MDRAB對14種抗生素的耐藥結(jié)果及超廣譜酶基因檢測結(jié)果見表3。

2.3 耐藥基因陽性結(jié)果及測序后結(jié)果

38株MDRAB中TEM基因陽性33株（86.84%，圖1為部分結(jié)果），PER-1基因陽性5株（13.16%）、SHV基因陽性1株（2.63%）（見圖2）。其中，5株TEM、PER-1基因均陽性，占13.16%；1株TEM、SHV基因均陽性，占2.63%。取TEM、PER-1和SHV基因所有陽性產(chǎn)物純化并送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，結(jié)果和GenBank上報道的已知序列相比對，證實為TEM、PER-1和SHV，同源性均為99%。

3 討論

我院分離的38株MDRAB占所有不動桿菌（62株）的61.29%，高于2009年[1]CHINET細菌檢測數(shù)據(jù)的44%。我院的ICU為綜合ICU，同時收住呼吸、神經(jīng)外科和骨創(chuàng)外科等危重癥病人，好轉(zhuǎn)后再轉(zhuǎn)到相應(yīng)科室，加上包括呼吸機在內(nèi)的有創(chuàng)性治療措施的廣泛應(yīng)用，此為MDRAB的傳播和流行提供了很好的機會。因此，加強醫(yī)院管理，積極有效地控制鮑曼不動桿菌感染和傳播是極其重要的。

本研究顯示，38株菌全部符合多重耐藥不動桿菌（對以下3種或3種以上抗生素耐藥：頭孢菌素類、碳青霉烯類、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、氟喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素）標準。由表3可見，對阿米卡星敏感率為15.79%（6株），耐藥率為84.21%（32株）；對妥布霉素敏感率為13.16%（5株），耐藥率86.84%（33株）；對頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸耐藥率均為92.11%（35株），僅7.89%（3株）對頭孢他啶敏感，但對替卡西林/克拉維酸為中介（7.89%），無敏感菌株。對其余9種抗生素包括頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟耐藥率均為100%，無敏感菌株。其中的30株菌對14種抗生素全部耐藥，導(dǎo)致幾乎無藥可選。而且相對敏感的氨基糖苷類抗生素因副作用及短期內(nèi)極易產(chǎn)生耐藥性限制了其在臨床的長期、廣泛應(yīng)用。對于感染MDRAB的患者，其治療費用及死亡率勢必增加，預(yù)后極差。

本研究中38株MDRAB中33株均產(chǎn)生TEM型β-內(nèi)酰胺酶。近年來國內(nèi)在鮑曼不動桿菌中已經(jīng)檢測到了TEM、CTX、SHV、PER-1、VEB、GES等基因，但仍以TEM和PER-1檢出率最高。TEM是革蘭陰性桿菌中最常見耐藥基因，可使細菌對青霉素和第3、4代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素耐藥，但對頭霉素及碳青霉烯類抗生素敏感。PER-1在鮑曼不動桿菌中檢出的報道日益增多，其既可為質(zhì)粒編碼又可為染色體編碼，在上游存在插入序列ISPa12，此序列可能與提高其表達有關(guān)[6]。PER-1可以水解廣譜頭孢菌素、頭孢哌酮/舒巴坦及氨芐西林/舒巴坦，但不水解或較弱水解亞胺培南和美羅培南。此外，PER-1還可以導(dǎo)致對氨基糖苷類抗生素的耐藥，如慶大霉素及阿米卡星，因此也更有力地表明了多重耐藥的存在。國外也有大量PER-1的報道，特別是在韓國、土耳其非常流行，也見于法國、比利時和玻利維亞[7，8]。國內(nèi)也有多家醫(yī)院報道了PER-1基因的存在；PER-2在阿根廷、美國也有報道。本研究中發(fā)現(xiàn)了1株攜帶SHV基因的耐藥菌株，在我國北京、廣州、福州等[9]地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了SHV的鮑曼不動桿菌。雖然SHV基因不是我院的鮑曼不動桿菌多重耐藥最主要的原因，但也要引起警惕。發(fā)現(xiàn)5株同時攜帶TEM和PER-1基因，1株同時攜帶TEM和SHV，應(yīng)密切觀察和監(jiān)控這樣的危險菌株，防止其在院內(nèi)暴發(fā)和流行。

本研究中有5株MDRAB的PCR擴增產(chǎn)物均為陰性，一方面是由于未對所有的耐藥基因進行檢測；另一方面細菌耐藥機制除產(chǎn)超廣譜酶基因酶以外，還同時存在著產(chǎn)其他β-內(nèi)酰胺酶如Ampc酶、青霉素結(jié)合蛋白親和力下降、外膜孔蛋白（OprD）缺失及主動外排泵等其他的耐藥機制。目前認為，整合子不僅可以介導(dǎo)細菌耐藥性聚集導(dǎo)致多重耐藥產(chǎn)生，而且可以在不同遺傳物質(zhì)和菌株間轉(zhuǎn)移，這些將有待于進一步研究。

表3 38株MDRAB藥物耐藥性及超廣譜酶基因檢測結(jié)果Tab 3 Drug resistance and extented-specturm β-lactamase genes of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

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