紙層析法分離鑒定檸檬酸

路 敏

（晉中學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山西 晉中 030600）

檸檬酸因其無毒、安全、酸味可口等特點(diǎn)，作為酸味劑和抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品與飲料工業(yè).70年代以后，檸檬酸在其他工業(yè)領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用，特別是在洗滌劑中代替磷酸鹽作為增效助劑[1]，在生產(chǎn)無磷洗滌劑中擔(dān)任了重要角色.

在發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的研究工作中，檸檬酸的定性、定量測(cè)定方法有很多，如紙層析法、薄層層析法、酸堿滴定法、光化學(xué)法、分光光度法、色譜法等.酸堿滴定法雖操作簡(jiǎn)便，但選擇性差，有機(jī)酸干擾嚴(yán)重；分光光度法需要生物堿分解樣品，十分繁瑣；色譜法具有較高的靈敏度和選擇性，但設(shè)備昂貴、測(cè)樣成本高.本文中采用紙層析法進(jìn)行定性測(cè)定檸檬酸.

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所需主要儀器有：AB104-N型電子分析天平，15cm×30cm層析缸，101-3型干燥箱，79-1型磁力加熱攪拌器.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所需主要試劑有：95%乙醇（A.R.）、冰醋酸（A.R.）、甲酸（A.R.）、正丁醇（A.R.）、氫氧化鈉（A.R.）、檸檬酸（A.R.）、草酸（A.R.）、蘋果酸（A.R.）、溴甲酚綠（A.R.）.

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取0.3g分析純的檸檬酸，溶解后定容至100mL，即得3g/L的檸檬酸溶液，同樣方法配制3g/L的蘋果酸、草酸溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液.檸檬酸發(fā)酵液預(yù)處理后所得濾液濃度約為100g/L，將其稀釋30倍使用.

2 方法與結(jié)果

2.1 濾紙的準(zhǔn)備、點(diǎn)樣及展開方式

2.1.1 展開濾紙的準(zhǔn)備

新華3號(hào)層析濾紙，裁成30cm×20cm備用，注意使短邊的方向和濾紙的纖維方向一致.在距濾紙的長(zhǎng)邊一側(cè)2cm處用鉛筆劃一直線，在該直線上均勻分布各點(diǎn)樣點(diǎn).

2.1.2 點(diǎn)樣及展開方式

用鉛筆在距濾紙邊線2cm左右劃一直線（稱為原線），線上每隔2cm劃一圓點(diǎn)（稱為原點(diǎn)）.然后用毛細(xì)管吸取樣品液點(diǎn)在原點(diǎn)，樣品點(diǎn)的直徑約為0.3cm～0.5cm，點(diǎn)樣量約為 5μg～30μg[2].點(diǎn)樣采取少量多次點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣的位置應(yīng)完全重合，以免出現(xiàn)斑點(diǎn)畸形現(xiàn)象.

濾紙的展開方式有上行展開法、下行展開法、多向展開法[2]等，論文中采用最常用的上行展開法.

點(diǎn)樣后、展開前，先將濾紙與層析缸用配好的展開溶液的蒸汽來飽和，以免造成展開體系的組分發(fā)生改變，影響層析效果.

平衡結(jié)束后，將濾紙靠近點(diǎn)樣點(diǎn)的一端浸入展開劑，展開液面距離原線距離約1cm，開始展開.當(dāng)展開液到達(dá)距離濾紙的另一端1cm～2cm處時(shí)，展開結(jié)束.

2.2 展開劑配比的確定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用于檸檬酸發(fā)酵液分離的展開體系多為正丁醇、甲酸、水按一定比例組成[3].論文中也采用該體系，通過大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，逐步調(diào)整各物質(zhì)在體系中的比例，最終確定的展開體系為正丁醇﹕甲酸﹕水﹕冰醋酸＝4﹕1﹕4﹕1（體積比），所得到的紙圖譜見圖1.

2.3 展開溫度的影響

有機(jī)相中的含水量改變，溶質(zhì)的Rf值也相應(yīng)改變.水在有機(jī)相中的溶解度是隨溫度的變化而變化，所以展層溫度的改變會(huì)使Rf值有所改變.分別在10℃、20℃與30℃下用同一展開體系進(jìn)行展開，所得展開效果見圖2，圖3，圖4.

圖1 紙層析法分析圖譜

圖2 10℃下展開紙色譜效果圖

圖3 20℃下展開紙色譜效果圖

圖4 30℃下展開紙色譜效果圖

通過實(shí)驗(yàn)，在10℃下展開耗時(shí)4h，展開速度較慢，由圖2可以看出，樣品斑點(diǎn)位置普遍較低，沒有很好地將各物質(zhì)區(qū)分開；相反，在30℃下展開僅需1.5h，展開速度較快，由圖4可知，樣品斑點(diǎn)位置普遍較高，也沒有很好將各物質(zhì)區(qū)分開；在20℃下展開需2h，從圖3可得，各樣品斑點(diǎn)能夠被很好地分離開.

2.4 顯色

展開結(jié)束后，取出濾紙，自然晾干.用2g/L的溴甲酚綠-乙醇溶液作為顯色劑，顯色劑中加入0.1mol/L的NaOH調(diào)成藍(lán)綠色，用噴霧法進(jìn)行顯色.在噴顯色劑時(shí)，必須在整張濾紙上噴灑均勻，而且用量要適度，然后在100℃下烘干即可.由于溴甲酚綠遇酸呈黃色、遇堿呈深藍(lán)色，所以得到的紙色譜為藍(lán)色（或綠色）背景下的黃色斑點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該體系并不是十分理想，雖然可以分離各種有機(jī)酸，但草酸的拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重.經(jīng)過多次試驗(yàn)摸索，最終發(fā)現(xiàn)在體系中加入10%（V/V）的冰醋酸后，展開效果得以改善，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5.

由圖5可以看出，在紙層析圖譜中，發(fā)酵液中除檸檬酸外，其他雜酸并未出現(xiàn).但用醋酸鈣-醋酸溶液檢測(cè)，有白色沉淀生成，說明發(fā)酵液中有草酸存在.之所以在紙圖譜中未發(fā)現(xiàn)草酸，究其原因?yàn)椴菟岷枯^低，發(fā)酵液經(jīng)過稀釋后點(diǎn)樣，其中草酸的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于紙層析法所能檢測(cè)的范圍，因此未能檢測(cè)到.

圖5 檸檬酸發(fā)酵液紙層析法分析圖譜

3 結(jié)論

通過上述實(shí)驗(yàn)可得，對(duì)檸檬酸發(fā)酵液中所含的主要有機(jī)酸可通過紙色譜法進(jìn)行定性分析.通過多次點(diǎn)樣，以配比(體積比)為：正丁醇﹕甲酸﹕水﹕冰醋酸＝4﹕1﹕4﹕1為展開體系，在 20℃下，采用上行展開法展開.然后用2g/L的溴甲酚綠-乙醇溶液顯色，100℃下烘干.通過測(cè)定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值，可以定性判斷樣品及其純度.同時(shí)，若樣品中含有其它與標(biāo)準(zhǔn)樣濃度相近的雜酸，紙層析法可以將各種酸分離開來.

〔1〕彭奇均，孫培東.檸檬酸鈉在洗滌劑中的應(yīng)用及發(fā)展前景[J].日用化學(xué)工業(yè)，1996(4):27-30.

〔2〕周同惠.紙色譜和薄層色譜[M].北京：科學(xué)出版社，1989.56-125.

〔3〕陳騊聲，徐定邦，沙曼云，等.有機(jī)酸發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1993.1-142.