復(fù)方甘草酸苷制劑對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

王 松， 王 微， 羅 猛， 趙修華， 祖元?jiǎng)偅?趙艷麗

(東北林業(yè)大學(xué)教育部林業(yè)生物制劑工程研究中心森林植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

炎癥是機(jī)體受到各種致炎因素的刺激和損傷后為滅活及移除這些致炎因素并為組織修復(fù)創(chuàng)造環(huán)境而產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，是一種十分常見(jiàn)而又重要的基本病理過(guò)程，是許多疾病的癥狀或并發(fā)癥，可引起局部或全身性反應(yīng)。其主要由細(xì)菌和病毒引起，也可因物理、化學(xué)、外傷等刺激而產(chǎn)生［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，為重要的炎癥反應(yīng)觸發(fā)劑，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞起著重要作用，是體內(nèi)啟動(dòng)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞即是參與炎癥反應(yīng)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白介素 IL-1β、-6、-10 等細(xì)胞因子的重要來(lái)源［2-4］，為調(diào)控炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，由炎癥反應(yīng)所致免疫防御和免疫功能紊亂過(guò)程中，巨噬細(xì)胞是一個(gè)關(guān)鍵的參與者。所以，研究LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性和抗炎性細(xì)胞因子的效應(yīng)，有助于人們對(duì)炎癥反應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并尋找到其有效防治手段。

在日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社研制的復(fù)方甘草酸苷(compound glycyrrhizin，GL)片劑(GLT)和注射劑(GLI)2種劑型中，GLT主要成分為甘草酸苷(即甘草酸單銨鹽)、甘氨酸和蛋氨酸，而GLI則以甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸和甘氨酸為主成分，輔料有亞硫酸鈉、適量氨水和氯化鈉。這2種復(fù)方制劑均具有抗炎和類鹽皮質(zhì)激素的作用，同時(shí)還具有抑制病毒增殖、免疫調(diào)節(jié)、降低轉(zhuǎn)氨酶、改善肝組織損傷、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等多種生物學(xué)作用，臨床上主要用于治療慢性肝炎、濕疹、皮膚炎、過(guò)敏性紫癜、水痘、銀屑病及斑禿等疾病，并有良好療效［5-6］。研究表明，炎癥反應(yīng)其本質(zhì)就是機(jī)體內(nèi)促炎-抗炎自穩(wěn)失衡所致。在參與炎癥反應(yīng)的眾多因子中，最重要的是炎癥因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)，它們與內(nèi)毒素休克的發(fā)病與致死具有密切關(guān)聯(lián)［7-9］。本文旨在通過(guò)研究GLT和GLI對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌促炎和抗炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎癥介質(zhì)NO的調(diào)節(jié)作用，探討GL的抗炎作用機(jī)制，為其用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其間，選用地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照藥，它為一種糖皮質(zhì)激素類抗炎藥，可部分抑制NO生成，其作用確切，臨床應(yīng)用廣泛。

1 材料

1.1 藥物與試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，均為Hyclone公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(Gibco公司);EDTA，MTT(噻唑藍(lán))，LPS，均為 Sigma公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO，Amerseco公司);NO檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);小鼠的TNF-α及IL-6、-1β和-10的ELISA試劑盒(ELISA Kits，R＆D公司);GLT(每片含甘草酸苷35 mg，批號(hào):09059)，GLI(每支20 mL，含甘草酸苷 53 mg，批號(hào):E0211)，均為衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;地塞米松(Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 儀器

DL-CJ-2N型超凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);DK-98-1型電子恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);StatFax-2100型酶標(biāo)儀(美國(guó)Awareness公司);CO2培養(yǎng)箱(SIM公司);TS-100型倒置顯微鏡(美國(guó)AWARENESS公司)。

2 方法

2.1 藥物溶液配制

GLT藥液配制:取GLT，用研缽研成粉末，置于139 mL含有2%血清的DMEM培養(yǎng)液中，超聲溶解，使甘草酸苷濃度為 300 μmol·L-1，放置過(guò)夜，使用前以0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌，并用含有2%血清的DMEM培養(yǎng)液倍半稀釋，使甘草酸苷濃度分別達(dá)150 和 75 μmol·L-1，即得 300、150 和 75 μmol·L-1的3個(gè)濃度GLT藥液。

GLI藥液配制:取 GLI，用含有 2%血清的DMEM培養(yǎng)液以10.5倍稀釋，使甘草酸苷濃度為300 μmol·L-1，放置過(guò)夜，使用前同上處理和稀釋，即得300、150 和75 μmol·L-1的3 個(gè)濃度 GLI藥液。

地塞米松藥液配制:取地塞米松粉末100 μg，溶解于2 mL含有2%血清的DMEM培養(yǎng)液中，制得濃度為127 μmol·L-1的藥液，使用前再用培養(yǎng)液稀釋至 1.27 μmol·L-1即可。

LPS溶液配制:取LPS粉末1 mg，溶解在1 mL生理鹽水中，制成質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1的LPS溶液，使用前用含有2%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至10 或 1 mg·L-1即可。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW 264.7細(xì)胞置于高糖DMEM培養(yǎng)基中，并添加10%胎牛血清以及青霉素和鏈霉素各100 mg·L-1，隨后在 37 ℃、潮濕、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為每毫升4×105個(gè)的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過(guò)夜;吸棄各孔培養(yǎng)液，分組處理，即GLT和GLI藥液各濃度組分別加入300、150 和75 μmol·L-13 個(gè)濃度的相應(yīng)藥液，LPS模型組加1 mg·L-1LPS溶液，空白對(duì)照組加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組平行5孔，各孔加液體積為200 μL，繼續(xù)培養(yǎng);24 h后，各孔加入20 μL MTT 的生理鹽水溶液(5 g·L-1)，再培養(yǎng)4 h;吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶解，水平振蕩器搖動(dòng)10 min，用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)492 nm和參比波長(zhǎng)630 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算各組細(xì)胞活力，并將空白對(duì)照組細(xì)胞活力計(jì)作100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Griess實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為每毫升4×105個(gè)的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過(guò)夜;棄去各孔培養(yǎng)液，分組處理，即GLT和GLI藥液各濃度組分別加入300、150和75μmol·L-13個(gè)濃度的相應(yīng)藥液，LPS模型組和空白對(duì)照組加含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加 1.27 μmol·L-1地塞米松藥液，每組平行5孔，各孔加液體積為180 μL;處理1 h后，空白對(duì)照組加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其他各組均加10 mg·L-1LPS溶液(LPS最終質(zhì)量濃度為1 mg·L-1)，每孔加液體積為20 μL;培養(yǎng)24 h 后，吸取各孔培養(yǎng)液50 μL，加入等體積的Griess試劑1和試劑2，室溫反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光值，依據(jù)所測(cè)亞硝酸鹽濃度，推算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量，繼而計(jì)算各藥液組對(duì)LPS處理的細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并進(jìn)行組間比較。抑制率=(LPS模型組吸光值-各藥液組吸光值)/(LPS模型組吸光值-空白組吸光值)×100%。

2.5 雙抗體夾心ABC-ELISA實(shí)驗(yàn)

該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)旨在考察不同濃度GLT和GLI藥液對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌促炎和抗炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10的影響，其前部分細(xì)胞分組、處理等設(shè)計(jì)同“2.4”節(jié);各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照各細(xì)胞因子相應(yīng)的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，吸取各孔培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組培養(yǎng)液中TNF-α及IL-1β、-6和-10的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并進(jìn)行組間比較。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方甘草酸苷片劑和注射劑對(duì)細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GLT和GLI藥液各濃度組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組和LPS模型組無(wú)顯著差異(P＞0.05)(見(jiàn)圖1)。提示，GLT和GLI藥液在0～300 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì) RAW264.7 細(xì)胞的活力無(wú)影響。

圖1 MTT實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞活力比較(n=15)Figure 1 Comparison of cell viability among all groups in MTT test

3.2 復(fù)方甘草酸苷片劑和注射劑對(duì)脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用

Griess實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量較空白對(duì)照組顯著提高，說(shuō)明LPS可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，體外炎癥模型建立成功;GLI藥液在75、150和300μmol·L-1濃度下對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率分別為13.8%、40.4%和53.8%，而GLT藥液在這3個(gè)濃度下的抑制率分別為9.8%、27.1%和37.8%，地塞米松在1.27 μmol·L-1濃度下的抑制率為27.1%(見(jiàn)圖2)。表明，GLT和GLI能不同程度地顯著抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO，并呈濃度依賴性，且其作用與陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松類似，其中GLI的抑制作用稍強(qiáng)于GLT。

圖2 Griess實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液的亞硝酸鹽濃度比較(n=15)Figure 2 Comparison of nitrite concentration in cell culture among all groups in Griess test

3.3 復(fù)方甘草酸苷片劑和注射劑對(duì)脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1β、-6和-10的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LPS模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α及IL-1β、-6和-10含量顯著提高;與LPS模型組比較，在75、150和300 μmol·L-1的GLI藥液組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量分別降低29.8%、41.5%和52.1%，IL-1β含量分別降低39.5%、55.6%和69.6%，IL-6含量分別降低18.3%、29.5%和39.1%，IL-10含量則分別提高8.2%、23.8% 和 30.8%，而在 75、150 和 300 μmol·L-1的GLT藥液組細(xì)胞培養(yǎng)液中，TNF-α含量分別降低16.6%、37.0%和48.4%，IL-1β含量分別降低28.1%、47.9%和57.9%，IL-6含量分別降低13.5%、19.9%和28.2%，IL-10含量則分別提高3.9%、14.8%和23.4%，此外，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α及IL-1β和-6含量分別降低47.5%、53.8%和44.7%，IL-10 含量則提高 23.0%(見(jiàn)圖 3、4、5、6)?？梢?jiàn)，GLT和GLI能不同程度地顯著抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1β和-6以及進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-10，并呈濃度依賴性，且其作用與陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松類似，其中GLI的作用強(qiáng)于GLT。

圖3 ELISA實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液的TNF-α含量比較(n=15)Figure 3 Comparison of TNF-α content in cell culture among all groups in ELISA test

圖4 ELISA實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液的IL-1β含量比較(n=15)Figure 4 Comparison of IL-1β content in cell culture among all groups in ELISA test

圖5 ELISA實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液的IL-6含量比較(n=15)Figure 5 Comparison of IL-6 content in cell culture among all groups in ELISA test

圖6 ELISA實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液的IL-10含量比較(n=15)Figure 6 Comparison of IL-10 content in cell culture among all groups in ELISA test

4 討論

GL目前已在臨床上廣泛應(yīng)用，療效顯著，而抗炎是其主要藥理作用。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)炎癥、疼痛、病毒復(fù)制以及一些免疫疾病中關(guān)鍵因子基因表達(dá)的作用，如在炎癥發(fā)生過(guò)程中，其能調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α、誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)等基因的表達(dá)，故阻斷NF-κB通路是抗炎治療的有效途徑［10-11］，包括地塞米松等抗炎藥都是通過(guò)抑制NF-κB 的活性來(lái)降低 IL-1β、TNF-α、NO 等的生成，從而達(dá)到治療目的。本研究成功建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7體外炎癥模型，并考察了GL在不同濃度下對(duì)其中NO、TNF-α及IL-1β、-6和-10等炎癥因子分泌的調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞水平上證實(shí)了GL具有與地塞米松等甾體類藥物相似的良好抗炎活性。

在本研究中，考慮到GLI原液的濃度約為3154 μmol·L-1，而作用于細(xì)胞的藥物濃度過(guò)高(即稀釋倍數(shù)過(guò)低)可能會(huì)因毒性作用而影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，所以，基于預(yù)實(shí)驗(yàn)和GLI市面上出售的藥品規(guī)格，把GLT和GLI藥液的實(shí)驗(yàn)濃度選定稀釋在0～300 μmol·L-1范圍內(nèi)。結(jié)果表明，與LPS模型組相比，GL可濃度依賴性地顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-1β和-6等促炎因子，并能促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，顯示了其體外抗炎效應(yīng)。其中，在高濃度下，GLI對(duì)NO、TNF-α和IL-1β的細(xì)胞分泌抑制率都超過(guò)50%，而GLT只有對(duì)IL-1β的細(xì)胞分泌抑制率超過(guò)50%，且整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，GLI的各項(xiàng)體外抗炎活性數(shù)據(jù)均優(yōu)于GLT。究其個(gè)中緣由，筆者以為，可能與注射液對(duì)生產(chǎn)工藝以及藥物純度等各方面的要求嚴(yán)于或優(yōu)于片劑有關(guān)。

依據(jù)本研究結(jié)果，可以初步推測(cè)GL的抗炎作用機(jī)制是阻斷NF-κB活性，因此筆者所在研究團(tuán)隊(duì)下一步將深入探究GL對(duì)NF-κB等通路的作用，進(jìn)一步闡釋GL的抗炎機(jī)制。

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