黏細(xì)菌93431次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化及活性測(cè)定

劉 斌，王鴻鵬，陳 川，張利平，石 楠，湯 輝，郭立格

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新診斷乳腺癌≥120萬(wàn)例［1～3］。乳腺癌給患者帶來(lái)了巨大的痛苦。尋找治療乳腺癌的特效藥物一直是新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。黏細(xì)菌是一類單細(xì)胞［4］、長(zhǎng)桿狀［5］、可滑行運(yùn)動(dòng)［6］的革蘭陰性菌，在系統(tǒng)分類上屬于紫細(xì)菌類群的δ分支，共12個(gè)屬約40個(gè)種［7］。黏細(xì)菌以二等分分裂繁殖，大多生長(zhǎng)在土壤中或食草動(dòng)物的糞便上，有的能分解纖維素［8］。黏細(xì)菌具有產(chǎn)生活性物質(zhì)種類多、結(jié)構(gòu)新且菌株差異大的特點(diǎn)［2，3］。黏細(xì)菌能產(chǎn)生種類眾多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中相當(dāng)一部分代謝物具有抗真菌、抗細(xì)菌以及抗腫瘤等生物活性［9］，而且作用機(jī)制多種多樣，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約100種黏細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)和600種結(jié)構(gòu)類似物［10］，為新結(jié)構(gòu)或新作用機(jī)制生物活性物質(zhì)的篩選提供了一類良好的微生物資源。黏細(xì)菌已經(jīng)成為繼放線菌、芽孢桿菌之后的第三大次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌。為了尋找新的抗腫瘤活性成分，2011年8月3日～11月20日，我們對(duì)黏細(xì)菌93431的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，從中分離到4種組分，利用MTT法對(duì)這4種組分的活性進(jìn)行了檢測(cè)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黏細(xì)菌93431菌株由河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC，由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng)。

1.1.3 試劑及器材 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法參見文獻(xiàn)［11］;D312大孔吸附樹脂(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司);RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);分析型高效液相色譜儀(日立L-2000，DAD 檢測(cè)器，Thermo ODS-2，5 μm，250 mm ×4.6 mm);制備型高效液相色譜儀(美國(guó)SSI Prep Pump，Model 2001，GRACE Allsphere ODS-2，5 μm，250 mm×4.6 mm);自動(dòng)離心濃縮儀(英國(guó) miVac QUC-23050-100);顯微鏡(OLYMPUSBH-2 JAPAN);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(德國(guó)BMG FLUOstar OPTIMA);冷凍干燥儀(SIM MCFD5508型)。

1.2 方法

1.2.1 黏細(xì)菌93431菌株發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的粗提 將93431菌種接種于CAS液體種子培養(yǎng)基，置于搖床中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。再將種子液以10%接種量接種到VY/2液體發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量300 mL)，搖床中28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液4 800 r/min離心10 min，除去上清液，收集得到菌體及樹脂，向其加入15倍體積的甲醇，置于搖床上振蕩，過(guò)夜浸提，浸提液用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物。

1.2.2 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物的分離純化

將得到的發(fā)酵產(chǎn)物用分析型高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫(流動(dòng)相組分及其比例見表1)，初步了解發(fā)酵產(chǎn)物的組成成分。針對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中含量較高的組分，設(shè)計(jì)洗脫方法，利用制備型高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離制備。將收集得到的不同組分置于自動(dòng)離心濃縮儀中，37℃真空離心濃縮，除去甲醇。－80℃低溫冰箱中過(guò)夜后，置冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，除去水分后得到干品。

表1 高效液相色譜梯度洗脫流動(dòng)相組分及其比例

1.2.3 黏細(xì)菌93431菌株代謝產(chǎn)物活性測(cè)定及毒性檢測(cè) 93431菌株代謝產(chǎn)物的活性測(cè)定采用MTT法［12］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成1×104/mL，每孔180 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將分離得到的93431菌株代謝產(chǎn)物樣品用完全培養(yǎng)基溶解，0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后再將樣品稀釋成4個(gè)濃度梯度，分別為100、50、25、12.5 μg/mL。樣品組每孔加入 20 μL，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，以不加樣品的孔作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察96孔板中各細(xì)胞形態(tài)的變化。然后每孔加入30μL的 MTT(5 mg/mL)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加 DMSO 150 μL/孔，將96孔板震蕩10 min后，492 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(OD值)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率=［1－(樣品孔OD值/空白對(duì)照孔 OD值)］×100%。93431菌株代謝產(chǎn)物的毒性檢測(cè)用MRC細(xì)胞模型，培養(yǎng)液改用含10%胎牛血清的DMEM，具體方法同上。

2 結(jié)果

2.1 93431菌株的性質(zhì)及發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果 93431菌株為革蘭陰性菌，呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，在固體VY/2斜面上培養(yǎng)4～5 d即形成圓球形淺黃色子實(shí)體，無(wú)柄，較黏軟。發(fā)酵液呈淺黃色且清澈透亮。

2.2 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化結(jié)果分離結(jié)果表明，93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物成分比較復(fù)雜。對(duì)含量較高的組分即保留時(shí)間50～60 min的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離。為了獲得93431菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的單一化合物，利用制備液相對(duì)其進(jìn)行分離制備，流動(dòng)相比例調(diào)整為甲醇∶水=72∶28，經(jīng)過(guò)制備液相分離純化，收集得到4種組分，即93431-1、93431-2、93431-3、93431-4，將這 4 種組分濃縮干燥后得到干品，均呈淺黃色粉末狀，易溶于甲醇。

2.3 93431菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物4種組分的活性測(cè)定及毒性檢測(cè)結(jié)果 4種組分對(duì)MCF-7的抑制效果見表2。4種組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制效果見表3。由表2和表3可以看出，組分93431-2、93431-3和93431-4在100μg/mL濃度作用24 h時(shí)，對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率分別為5.08%、12.47%和7.15%，顯示出較低的細(xì)胞毒活性，但遺憾的是這3種組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用也并不明顯，在同樣條件下，對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率分別為6.02%、19.55%和6.9%。而組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制作用，在100μg/mL、作用24 h時(shí)，抑制率達(dá)到51.65%，而在同樣條件下，對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率僅為17.54%。

另外，在加入93431-1(100μg/mL)作用24 h后，MCF-7在形態(tài)上發(fā)生了很大變化，細(xì)胞萎縮呈小球狀，細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，而空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，有光澤，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好。MRC細(xì)胞在加入93431-1后，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)與空白對(duì)照組相比并沒有發(fā)生太大變化。

表2 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

表3 93431菌株代謝產(chǎn)物各組分對(duì)MRC細(xì)胞的抑制率(ˉx ±s)

3 討論

對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌，通常用藥物進(jìn)行控制。但常用的化療藥物毒性很大，影響患者的生活質(zhì)量。因此，研究和開發(fā)高效、低毒的抗乳腺癌藥物格外重要。

本研究對(duì)河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室保藏的黏細(xì)菌93431菌株進(jìn)行活化、培養(yǎng)和發(fā)酵，進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取、收集，并利用分析型高效液相色譜對(duì)活性菌株的發(fā)酵液提取物進(jìn)行了各組分的分離、純化，利用MTT比色法篩選高效、低毒、有抗乳腺癌生物活性的物質(zhì)。為活性組分的制備和結(jié)構(gòu)測(cè)定以及為靶向抗乳腺癌藥物的開發(fā)和利用做準(zhǔn)備。

利用分析型高效液相色譜對(duì)93431菌株發(fā)酵液中次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化方法進(jìn)行了系統(tǒng)的探索，確定了菌株93431代謝產(chǎn)物的洗脫條件，建立了適合菌株93431發(fā)酵液中活性產(chǎn)物的分析方法，即用 Thermo ODS-2、5 μm、250 mm ×4.6 mm 的色譜柱，選擇甲醇和水為流動(dòng)相，設(shè)定流速為1 mL/min，進(jìn)行80 min梯度洗脫，從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)組分。

利用制備型高效液相色譜，即用GRACE Allsphere ODS-2、5 μm、250 mm ×10 mm 的色譜柱，選擇甲醇∶水=72∶28為流動(dòng)相，設(shè)定流速為4 mL/min，進(jìn)行70 min等梯度洗脫，從菌株93431的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分析出4個(gè)組分，分別命名為93431-1、93431-2、93431-3、93431-4。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組分93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，其濃度和其對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率之間存在較好的量效關(guān)系，隨著93431-1濃度的增長(zhǎng)，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制率也增大。但因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用樣品的最大濃度為100μg/mL，未能測(cè)得93431-1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最大抑制率。有待對(duì)組分93431-1、93431-2、93431-3和93431-4分別進(jìn)行配伍，并進(jìn)一步提高組分93431-1的濃度，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用做更完善的研究。

組分93431-1呈淺黃色粉末狀，有較強(qiáng)的極性，易溶于甲醇。采用MTT法以MCF-7、MRC細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行93431菌株代謝產(chǎn)物的活性及毒性測(cè)定，結(jié)果表明組分93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制效果明顯，在藥物濃度為100μg/mL作用24 h的條件下，93431-1對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率達(dá)到51.65%，且對(duì)MRC細(xì)胞毒性較小。對(duì)93431-1的結(jié)構(gòu)測(cè)定及其抗癌活性的機(jī)理的研究正在進(jìn)行之中。

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