杜仲對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

駱小娟，劉 蒙，張照慶，宋恩峰

(1武漢市第三醫(yī)院，武漢430060;2武漢大學(xué)人民醫(yī)院)

腎間質(zhì)纖維化是所有腎臟病進(jìn)行性發(fā)展的最終結(jié)果，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)。腎小管間質(zhì)病變程度是決定10 a腎臟存活率的最重要的影響因素，其影響較腎小球病變的嚴(yán)重程度更為重要［1］。諸多因素參與了腎間質(zhì)纖維化的病程，如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞的增殖和活化、血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子的作用以及ECM轉(zhuǎn)換失衡等。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是一種富含半胱氨酸的分泌多肽，是TGF-β下游效應(yīng)因子，介導(dǎo)促纖維化的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是調(diào)控ECM代謝的重要酶系，不僅是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)者，也是積極參與者，可通過(guò)對(duì)炎癥介質(zhì)的調(diào)控參與炎癥反應(yīng)，從而影響疾病的進(jìn)程［2］。杜仲是一傳統(tǒng)的補(bǔ)陽(yáng)藥物，臨床上常用于配合活血化瘀藥物延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，但其作用機(jī)制尚未明確，目前所見(jiàn)報(bào)道較少。我們于2010年7月～2011年6月進(jìn)行本研究，應(yīng)用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，通過(guò)檢測(cè)腎組織CTGF和MMP-2表達(dá)觀察杜仲對(duì)腎間質(zhì)纖維化的防治作用并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠32只(武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(200±20)g。溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(55±2)%，定時(shí)日光燈照射12 h/d，房間保持通風(fēng)、恒溫、安靜，定期更換墊料，清洗籠具。

1.2 藥物及試劑 CTGF抗體(兔抗鼠多克隆抗體，BA0752)，MMP-2抗體(兔抗鼠多克隆抗體，BA0569)，SP免疫組織化學(xué)試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德(Boster)生物有限公司;顯色底物為DAB，北京中山生物技術(shù)有限公司;杜仲(免煎中藥，批號(hào)0702014)，由三九醫(yī)藥股份有限公司提供;厄貝沙坦(批號(hào)0601137)由杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司提供。

1.3 模型的建立與分組 單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化大鼠模型:10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取右側(cè)臥位，背部左肋下備皮，常規(guī)消毒，選左側(cè)背部肋下0.5 cm為切口，打開腹腔，游離左腎及左側(cè)輸尿管，將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起，取中上段，用止血鉗夾住，在兩端用絲線結(jié)扎后剪斷左側(cè)輸尿管，然后逐層縫合;假手術(shù)組打開腹腔后即縫合。隨機(jī)分為4組:UUO組、假手術(shù)組、厄貝沙坦組和杜仲組。每組各8只，組間大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。手術(shù)前2 d開始給藥，假手術(shù)組、UUO組均給予等量生理鹽水灌胃，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦10 mg/(kg·d)、杜仲組給予杜仲6 g/(kg·d)灌胃。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)檢測(cè) 10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，從頸總動(dòng)脈采血，離心分離血清用于測(cè)定BUN、Scr。BUN采用脲酶—波氏比色法，Scr采用苦味酸法，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院生化室測(cè)定。

1.4.2 腎組織病理光鏡檢查 取左側(cè)腎組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，以3 μm的石蠟切片行HE、Masson染色。雙盲法觀察腎皮質(zhì)間質(zhì)變化情況。腎小管間質(zhì)損害程度按Mezzano方法進(jìn)行半定量分級(jí):0級(jí)正常;Ⅰ級(jí)為腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮、變性，壞死輕，呈灶性分布，少量散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生成小灶狀、少量分布，病變范圍＜25%;Ⅱ級(jí)為腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮、變性，壞死輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織中度增生，病變范圍25% ～50%;Ⅲ級(jí)為腎小管上皮細(xì)胞萎縮、變性和壞死重，呈片分布，大量彌漫或聚集成灶的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生呈束狀、多灶或網(wǎng)狀成片，病變范圍＞50%。觀察連續(xù)不重疊的10個(gè)高倍皮質(zhì)視野，綜合進(jìn)行評(píng)定。光鏡下觀察腎臟組織皮質(zhì)區(qū)腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及變化。切片應(yīng)用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖象分析軟件分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，測(cè)定一定面積內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)面積和陽(yáng)性信號(hào)平均灰度值，陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)(PI)=陽(yáng)性信號(hào)面積×陽(yáng)性信號(hào)平均灰度/測(cè)定面積。

1.4.3 腎組織免疫組織化學(xué)(SP法) 按SP法試劑盒說(shuō)明進(jìn)行CTGF、MMP-2表達(dá)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測(cè) 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Scr、BUN水平檢測(cè)結(jié)果(ˉx±s)

2.2 腎組織HE和Masson染色光鏡觀察結(jié)果 光鏡下假手術(shù)組腎小球及腎小管間質(zhì)正常;UUO組腎小管上皮細(xì)胞彌漫空泡變性，多數(shù)腎小管擴(kuò)張、萎縮，間質(zhì)多灶狀單核細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化;杜仲組間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞則呈小灶性浸潤(rùn)，少許上皮細(xì)胞腫脹，少部分腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯纖維化。Masson染色見(jiàn)假手術(shù)組腎臟的膠原染色主要位于腎小球基膜、Bowman囊、系膜區(qū)和腎小管的毛細(xì)血管周圍，而腎小管周圍間質(zhì)部分則比較狹窄;UUO組可見(jiàn)腎間質(zhì)大量膠原纖維增生，間質(zhì)膠原纖維呈藍(lán)色染色，間質(zhì)纖維化呈灶狀分布，腎小球病變不明顯，偶見(jiàn)腎小球局灶性節(jié)段性硬化;杜仲組上述改變均有所減輕，杜仲組與厄貝沙坦組組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。假手術(shù)組腎小管間質(zhì)病理分級(jí)0、Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)分別為8、0、0、0 例，UUO 組分別為0、4、3、1 例，厄貝沙坦組分別為 1、4、2、1 例，杜仲組分別為1、5、2、0 例。

2.3 免疫組織化學(xué)測(cè)定

2.3.1 CTGF蛋白表達(dá)分布 假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)、腎小球臟層上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)血管壁有少量表達(dá)，染色為顆粒狀，著色稀疏;UUO組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)明顯增多，呈不均勻顆粒狀，且與局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)增寬及腎小管損傷程度一致，腎小球表達(dá)不明顯;杜仲組表達(dá)較UUO組明顯降低，但仍較假手術(shù)組明顯增高。見(jiàn)表2、封三圖11。

2.3.2 MMP-2蛋白表達(dá)分布 MMP-2主要位于皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞管腔側(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，在腎小球和腎間質(zhì)中僅有少量分布;UUO組MMP-2表達(dá)較假手術(shù)組明顯減弱且分布面積減少;厄貝沙坦組和杜仲組MMP-2的表達(dá)較UUO組顯著增強(qiáng)且面積增加，但二組間無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2、封三圖12。

表2 各組大鼠CTGF和MMP-2的PI值變化(ˉx±s)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致的腎臟疾病慢性進(jìn)展，最終導(dǎo)致腎功能衰竭的共同機(jī)制，其主要病理基礎(chǔ)是ECM代謝失衡，在間質(zhì)異常積聚。目前研究認(rèn)為其發(fā)生機(jī)理可能如下［3］，一方面，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和各種細(xì)胞因子釋放，成纖維細(xì)胞激活和腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，生成肌成纖維細(xì)胞(MF)，MF具有強(qiáng)大的增殖、分泌能力，可產(chǎn)生過(guò)多的 ECM成分;另一方面，調(diào)控ECM代謝的基質(zhì)降解酶系統(tǒng)(MMPS/TIMPS系統(tǒng)和PA/PAI系統(tǒng))在各種細(xì)胞因子、細(xì)胞等因素作用下發(fā)生功能紊亂，使ECM降解減少。

UUO動(dòng)物模型是研究單純性腎間質(zhì)慢性炎癥和腎間質(zhì)纖維化的理想模型。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比UUO組大鼠梗阻側(cè)腎組織CTGF mRNA隨著TGF-β而顯著上調(diào)，繼之出現(xiàn)FN mRNA明顯上升、CTGF mRNA顯著增加［4］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化的結(jié)果顯示:假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞有較弱CTGF表達(dá)，其余各組大鼠的腎間質(zhì)中均有不同程度的表達(dá)，表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積，尤其在UUO組。術(shù)后2周UUO組、厄貝沙坦組與假手術(shù)組相比較CTGF表達(dá)呈顯著性增強(qiáng)，CTGF在厄貝沙坦組的表達(dá)顯著減弱于UUO組。MMP-2主要位于皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞管腔側(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，在腎小球和腎間質(zhì)中僅有少量分布，UUO組MMP-2表達(dá)較假手術(shù)組明顯減弱且分布面積減少，厄貝沙坦組和杜仲組MMP-2的表達(dá)較UUO組顯著增強(qiáng)且面積增加，二者無(wú)顯著性差異。

杜仲的主要功效成分有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖類、杜仲擴(kuò)真菌蛋白，此外杜仲還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等。杜仲具有調(diào)節(jié)血壓、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等藥理作用，以及延緩衰老、美白養(yǎng)顏、滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)壯筋骨等功效，是我國(guó)名貴的滋補(bǔ)中藥材，在中藥古典《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中就被列為藥之上品［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杜仲能減輕腎間質(zhì)纖維化，作用與厄貝沙坦相似，可抑制CTGF在UUO大鼠腎皮質(zhì)中表達(dá)的上調(diào)，增強(qiáng)MMP-2在腎間質(zhì)的表達(dá)。提示杜仲可能通過(guò)抑制CTGF在UUO大鼠腎小管上皮表達(dá)的上調(diào)，從而延緩腎小管損傷及間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

總之，杜仲抗腎纖維化的作用值得肯定，它可通過(guò)抑制CTGF的表達(dá)和增強(qiáng)MMP-2的活性進(jìn)而抑制纖維化的進(jìn)展。但是，其確切分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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