廣東省豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107外膜蛋白的提取

王文豪，張丹琳，蘇丹萍，賀東生

（華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 廣東省人畜共患病重點實驗室，廣東 廣州 510640)

豬大腸桿菌是條件性致病菌，可終年使豬群發(fā)病，且各年齡段的豬均可發(fā)病，尤其對仔豬的危害異常嚴重。多年來，對于大腸桿菌病的防控主要是通過接種滅活苗的方法進行的。這種方法固然起到一定的效果，但由于大腸桿菌血清型眾多，不同菌株的交叉免疫保護力低下。因此，滅活苗不能在很大的范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。而大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，且對不同菌株有交叉保護能力，是一種良好的保護性抗原[1-2]。外膜蛋白疫苗將會有較好的發(fā)展前景。本實驗從廣東省豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107中，選出一株有致病性的菌株，并對該菌株的外膜蛋白進行抽提，以期為外膜蛋白亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

腸致病性大腸桿菌O107由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病教研室分離鑒定得到。

1.2 主要化學試劑

2%的十二烷基肌氨酸,純度≥95%,分析純,過硫酸銨,sigma 公司產(chǎn)品。10 mmol/L的HEPES(N-2-羥乙基哌嗪- N′-2-乙磺酸),pH7.4,純度≥99%，分析純,丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺,Amresco 公司產(chǎn)品。Tris、溴芬蘭、甘油、β-巰基乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)試劑，低分子質(zhì)量蛋白Marker購買于Bio-Rad公司。

1.3 主要儀器

超速離心機，型號為BECKMANL8-M ,貝克曼產(chǎn)品。高速冷凍離心機( 6K15)，購于Sigma公司。超聲波細胞粉碎儀(FS300)，購于上海生析超聲儀器有限公司。氣浴恒溫振蕩器(搖床)，SHZ-82型，江蘇金壇中大儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 OMP 的提取

將菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取單個菌落接種于6 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h；培養(yǎng)物以4 ℃、6 000 g離心10 min；將沉淀懸浮于5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH 7.4 )中，78 W超聲裂解10 min;裂解物4 ℃、6 000 g離心10 min，棄去上清液；加入約5倍體積的2%N-十二烷基肌氨酸鈉室溫作用30 min，分裝于30 mL超速離心管中，10 ℃、110 000 g離心1 h；將沉淀懸浮于0.5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH值7.4)中,置-20 ℃保存，備用。

1.4.2 電泳檢測

1.4.2.1 SDS - PAGE 將上述外膜蛋白樣品15μL與等量樣品緩沖液混合，100 ℃水浴加熱5 min，加樣品于垂直電泳槽的樣品孔中，恒壓90 V電泳。樣品緩沖液為含4%SDS，20 %甘油,5%β-巰基乙醇，0.002 %溴酚藍的0.1 mol/L Tris HCl(pH6.8)。

1.4.2.2 考染 凝膠剝離后，用染色液(0.25%考馬斯亮蘭- R250、10%冰醋酸、50%甲醇)染色大約4 h后,用脫色液(5%甲醇、7%冰醋酸)振蕩脫色至條帶清晰背景干凈透明為止,拍照。

2 結(jié)果

大腸桿菌O107OMP的SDS - PAGE考染結(jié)果(見圖1)。

由圖1可見，菌株OMP條帶大致集中于31～37 ku之間， 菌株呈現(xiàn)2 條帶,這與報道的畜禽大腸桿菌主要OMP分子質(zhì)量相符，說明該實驗成功地提取了大腸桿菌外膜蛋白。

3 討論與分析

1）本實驗主要參考了高崧等報道的禽源性大腸桿菌OMPs 提取方法,對豬致病性大腸桿菌O107的OMPs 進行初步提取試驗。外膜蛋白是重要的毒力因子，試驗證明，抽提的外膜蛋白與基因工程表達出來的外膜蛋白都具有良好的免疫原性。本試驗針對廣東地區(qū)豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107的OMP做了初步提取,以期為OMP亞單位疫苗的研制的進一步研究提供基礎(chǔ)性材料。

圖1 E1coli OMP考染電泳圖

2）近年來的試驗研究表明，通過血清型鑒定試驗雖然可以給大腸桿菌分型，但此種方法不能反映不同大腸桿菌分離株之間的遺傳相關(guān)性,而外膜蛋白可反映病原性大腸桿菌分離株的遺傳標志。同一血清型的菌株可能屬于不同的外膜蛋白型，而不同血清型的菌株也可能屬于同一外膜蛋白型[3]。本實驗中豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型O107的OMP有2個條帶，外膜蛋白型為2型，是否廣東地區(qū)流行的血清型O107其他菌株也具有2條帶或不同的條帶數(shù)尚需進一步研究。

[1] 高崧，劉秀梵，張如寬.一種快速提取禽源性大腸埃希氏菌外膜蛋白的方法[J].微生物學通報,1996,23(2):122-124.

[2] 高崧，等.我國部分地區(qū)禽源性大腸桿菌的外膜蛋白型[J].微生物學報,1999,39(3):226-233.

[3] 丁伯良，鄢明華，王英珍，等.天津地區(qū)雞致病性大腸桿菌血清型分布及其優(yōu)勢血清型的外膜蛋白型研究[J].動物醫(yī)學進展，2003,24（2）：94-96.