阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷后硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和多配體蛋白聚糖的干預(yù)作用

曹明晶 周 平 李法琦 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)中的一種蛋白聚糖，具有多種重要的生物學(xué)功能，如維持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，維持血管通透性，抑制細(xì)胞黏附〔1～3〕，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖等。多配體蛋白聚糖(SDC－1)屬于黏附分子整合素跨膜黏結(jié)蛋白聚糖家族成員，在炎癥過程中通過其胞外段硫酸乙酰肝素鏈(屬于GAGs)共價結(jié)合多種胞外配體，結(jié)合各種生物分子及調(diào)節(jié)各種結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能，參與炎癥反應(yīng)的多個環(huán)節(jié)〔4〕。但有關(guān)HSPG和SDC－1在心肌缺血再灌注的表達水平及阿托伐他汀對兩者的影響鮮見報道。本實驗以大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)為模型，分析阿托伐他汀對大鼠MIRI后HSPG和SDC－1的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，合格證號:SCXK(渝)2007－0001，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 阿托伐他汀(大連輝瑞制藥有限公司)，HSPG、syndecan－1單克隆抗體(Santa Cruz)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，RT－PCR 試劑盒(TaKaRa)，HSPG、SDC－1 ELISA 試劑盒(R＆D)。

1.3 實驗分組與給藥 健康SD大鼠40只，隨機分為4組，每組10只，建造MIRI模型。假手術(shù)組:只穿線不結(jié)扎冠狀動脈;IR組:穿線結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min;阿托伐他汀組:穿線結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min，手術(shù)前3 d給予阿托伐他汀(20 mg·kg－1·d－1)灌胃;生理鹽水組:穿線結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min，手術(shù)前3 d給予生理鹽水1 ml灌胃。實驗結(jié)束后各組隨機抽取4只制作病理切片，其余各組6只觀察其他指標(biāo)。

1.4 實驗方法與觀察指標(biāo)

1.4.1 實驗動物MIRI模型的制作 大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，氣管插管，接動物人工呼吸機(80次/min，潮氣量20 ml/kg，呼吸比1∶1)，鏈接多功能生理記錄儀記錄心電圖。在胸骨左緣3、4肋間開胸，打開心包膜，暴露心臟。于冠狀動脈左前降支起始0.2 cm處與肺動脈圓錐旁之間墊一2 mm聚乙烯小管加壓，用6－0縫線結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min。結(jié)扎成功即心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，局部心肌明顯變蒼白，再灌注成功即蒼白心肌恢復(fù)紅潤或出現(xiàn)再灌注心律失常。

1.4.2 心肌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的觀察 實驗結(jié)束立即取下心臟，用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血后迅速放入4%多聚甲醛中固定。從心尖以間距0.3 cm橫向連續(xù)切片至冠脈穿線處，石蠟包埋切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)變化。

1.4.3 免疫組化檢測冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1表達每只大鼠石蠟切片5張，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，抗HSPG(1∶100)、SDC－1(1∶50)抗體孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 RT－PCR檢測HSPG、SDC－1 mRNA表達 每組大鼠隨機取6只快速留取冠狀動脈左前降支，加液氮研磨，按試劑盒說明用Trizol提取的步驟進行總RNA提取，得到的總RNA測定OD值，取OD值在1.8～2.0之間的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄步驟按試劑盒說明進行。每一標(biāo)本取 cDNA 1 μl進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為25 μl。所用引物由上海Invitrogen生物技術(shù)公司合成:HSPG正義鏈:5′－GAT CTGACAACATCCCAACTGA－3′，反義鏈:3′－AACAACAGGATGAGGAAAATGG－5′(302 bp);SDC－1 正義鏈:5′－CAGCAGCAACACCGAGAC－3′，反義鏈:3′－CTCCTACCTTGACGGTTAG－5′(359 bp);GAPDH 正義鏈:5′－AGGCCGGTGCTGAGTATGTC －3′，反 義 鏈:3′－T GCCTGCTTC ACCACCTTCT－5′(530 bp)。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃ 延伸 45 s，共 35 個循環(huán)，72℃最后延伸5 min。取PCR產(chǎn)物3 μl，2%瓊脂糖上電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進行條帶光密度半定量分析，計算HSPG、SDC－1 mRNA 相對值。

1.4.5 ELISA檢測血清中HSPG、SDC－1含量 實驗結(jié)束后經(jīng)頸靜脈取血，2000 r/min，離心5 min，取上層血清－20℃保存。根據(jù)試劑盒說明，ELISA法測定血清HSPG、SDC－1含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)的變化 光鏡下假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，染色均勻，橫紋清晰，心肌間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，無出血壞死;IR組心肌纖維腫脹，排列紊亂，有灶性出血，心肌間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤;阿托伐他汀組心肌纖維輕度腫脹，心肌間質(zhì)無出血，有少量不等的炎性細(xì)胞浸潤;生理鹽水組心肌組織形態(tài)與IR組相似。見圖1。

2.2 免疫組化檢測冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1表達 在假手術(shù)組冠狀動脈左前降支內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜處有較多HSPG和SDC－1陽性物質(zhì)的表達，但IR組HSPG和SDC－1的表達明顯減少或缺如，說明MIRI可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞糖萼受損。與IR組和生理鹽水組相比，阿托伐他汀組HSPG和SDC－1表達增多，提示阿托伐他汀可抑制內(nèi)皮細(xì)胞糖萼脫落。見圖2。

圖1 心肌組織HE染色(×100)

2.3 RT－PCR測定冠狀動脈左前降支 HSPG、SDC－1 mRNA表達 灰度掃描結(jié)果顯示，與假手術(shù)比，IR組大鼠冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1含量減少(P＜0.05)，但與生理鹽水組無明顯差異(P＞0.05);與IR組和生理鹽水組比，阿托伐他汀組大鼠冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)。見圖3、表 1。

2.3 ELISA檢測血清中HSPG、SDC－1含量變化 結(jié)果顯示，與假手術(shù)比，IR組大鼠血清中HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)，但與生理鹽水組無明顯差異(P＞0.05);與IR組和生理鹽水組比，阿托伐他汀組大鼠血清中 HSPG、SDC－1含量減少(P＜0.05)。見表1。

表1 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表達及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

表1 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表達及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與IR組比較:2)P＜0.05

組別 mRNA 血清1.07±0.04 0.98±0.05 233.83±0.99 34.17±0.73 IR組 0.37±0.021) 0.42±0.031) 827.53±0.981)119.44±0.941)阿托伐他汀組 0.71±0.401) 0.76±0.021)560.53±0.581)2)61.65±0.741)2)生理鹽水組 0.40±0.011)2)0.43±0.031)2)827.35±0.721)118.94±0.561)HSPG SDC－1假手術(shù)組HSPG SDC－1

圖2 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1表達(×100)

圖3 冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA表達

3 討論

HSPG是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)中的一種蛋白聚糖，具有多種重要的生物學(xué)功能，如維持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，維持血管通透性，抑制細(xì)胞黏附〔1～3〕，參與某些生長因子與其受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖等。由于其多樣化的結(jié)構(gòu)功能和在細(xì)胞識別、細(xì)胞黏附中的作用日益受到重視，成為當(dāng)今研究的熱點之一。SDC－1屬于黏附分子整合素跨膜粘連蛋白聚糖家族成員，通過其分子表面的硫酸肝素側(cè)鏈可結(jié)合一系列配基，如細(xì)胞黏附分子、基質(zhì)成分、生長因子、酶和酶抑制物等，以共受體方式調(diào)節(jié)細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與新生血管形成、傷口愈合以及白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用〔5〕。近年來，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用逐漸得到國內(nèi)外學(xué)者重視。

HMG－CoA還原酶抑制劑，能通過抑制HMG－CoA還原酶而抑制膽固醇的合成，是目前臨床上治療高膽固醇血癥最有效的一類藥物。但他汀類藥物除治療高脂血癥外，還具有以下重要作用〔6～8〕:①抗炎作用:大量的動物實驗已表明這類藥物能減少腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素－1和白細(xì)胞介素－6。②改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能:他汀類藥物通過激活磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶Akt通路，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶活性和NO的生成，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。本實驗結(jié)果說明在心肌缺血再灌注損傷中，阿托伐他汀可明顯減少炎性細(xì)胞的浸潤，減少心肌纖維斷裂壞死，維持細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見阿托伐他汀具有明顯心臟保護作用。

研究表明，心肌缺血在灌注本身是一種過度的炎癥反應(yīng)結(jié)果，在缺血壞死心肌灶上可見有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，而趨化因子及白細(xì)胞是心肌局部缺血的聯(lián)集反應(yīng)的起始原因之一〔9～11〕。即使缺血的心肌復(fù)流減少了心肌壞死，但再灌注的血液成分中含趨化因子募集來的炎癥介質(zhì)可損傷心肌，從而引起再灌注損傷。HSPG和SDC－1可通過抑制凝血及細(xì)胞黏附等生物功能發(fā)揮一系列血管保護作用。本實驗說明缺血再灌注損傷可使內(nèi)皮細(xì)胞上HSPG、SDC－1發(fā)生脫落，從而減弱其對血管的保護作用，本實驗阿托伐他汀可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞上HSPG、SDC－1脫落而發(fā)揮其心血管保護作用。但生物體是復(fù)雜的整體，其生物學(xué)反應(yīng)是復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的，外源因素與基因表達的作用也是非常復(fù)雜的，所以阿托伐他汀抑制內(nèi)皮細(xì)胞HSPGS、DC－1脫落的機制有待進一步研究。

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