老年呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐藥監(jiān)測及產(chǎn)ESBLs基因型分析

聶慶東 張秀梅 孫宇峰 劉志遠 謝 姣 (清華大學醫(yī)院檢驗科，北京 00084)

近年來，隨著我國抗菌藥物的廣泛使用，病原菌的耐藥情況日趨嚴重，細菌產(chǎn)生超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，是導致革蘭陰性菌對內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機制，并給臨床抗感染治療帶來眾多問題。肺炎克雷伯菌是引起呼吸道感染的重要病原菌之一，也是臨床常見的產(chǎn)ESBLs菌株〔2〕。本文對我院3年內(nèi)老年呼吸道感染患者痰液中分離出的肺炎克雷伯菌的耐藥譜進行分析，并對其中檢出含有ESBLs質(zhì)粒的基因型進行初步分型。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2009年1月至2011年12月本院診治的呼吸道感染老年患者496例，其中病房來源457例，門診39例;年齡61～86〔平均(71.2±10.9)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)及鑒定 細菌培養(yǎng)依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，按常規(guī)方法進行。細菌鑒定在API全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)中進行。血瓊脂、中國蘭及M－H瓊脂培養(yǎng)基為北京市陸橋公司產(chǎn)品。

1.2.2 藥敏實驗 采用K－B紙片擴散法，藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.2.3 ESBLs檢測 采用美國臨床實驗標準化委員會(NCCLS)推薦的雙紙片和表型確證試驗(頭孢他啶加克拉維酸，頭孢噻肟加克拉維酸)檢測肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)ESBLs。

1.2.4 ESBLs基因型檢測 提取培養(yǎng)后的肺炎克雷伯菌總DNA，采用PCR方法對產(chǎn)ESBLs菌株進行初步基因分型。PCR擴增體系為:DNA模板，1×PCR緩沖液(含 MgCl2)，0.5 μmol/L上、下游引物，0.25 mmol/L dNTP，1 U Taq DNA 聚合酶，總體積25 μl。反應條件為:94℃預變性2 min、94℃變性30 s、55℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，25 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。ESBLs型特異性引物均由生工生物工程(上海)有限公司代為合成，基因組提取試劑盒購自北京TIAGEN生化科技有限公司;PCR試劑盒來自大連寶生物工程有限公司。見表1。

表1 ESBLs基因型鑒定引物

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出率 496份痰液標本中病原菌培養(yǎng)陽性377例，檢出率為76.0%;病房來源的361例，門診來源僅16例。其中，分離出的肺炎克雷伯菌45株，占11.9%，其他檢出率較高的病原菌為銅綠假單胞菌(20.1%)、金黃色葡萄球菌(9.8%)、鮑氏不動桿菌(8.2%)及大腸埃希菌(7.9%)等。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐藥性檢測 藥敏實驗中發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對大部分抗生素還保持著較高的敏感性，尤其是對亞胺培南、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、阿米卡星的敏感性都保持在90%以上，僅對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復方新諾明耐藥率高，達60%以上。見表2。

表2 45株肺炎克雷伯菌的對抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株的基因分型 采用紙片法在45株肺炎克雷伯菌中鑒定出產(chǎn) ESBLs菌14株，檢出率達31.1%。通過PCR方法對這14株的ESBLs基因型進行了初步分型，結(jié)果顯示僅1株為單基因型，92.9%為雙基因或多基因型，檢出的基因型中以質(zhì)粒誘導酶(TEM)、頭孢噻肟酶(CTXM－14)和 β－內(nèi)酰胺耐藥相關(guān)酶(SHV)為主，分別為 7例(50%)、10例(71.4%)和6例(42.9%)，而 ESBLs基因型為CTX－M－1、CTX－M－2 及 OXA 的 僅 分 別 占 28.6%、7.1% 和7.1%。見表3。

表3 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株基因型分析

3 討論

呼吸道感染是老年患者最常見的感染，且臨床抗菌藥物的不合理應用導致耐藥菌株增多。與國內(nèi)其他地區(qū)結(jié)果相似〔3，4〕，本地區(qū)老年患者呼吸道感染以革蘭陰性菌為主。通過耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復方新諾明耐藥率高，達60%以上，與其他報道相接近〔4〕。目前，青霉素類抗生素耐藥已成了細菌感染治療的一個普遍現(xiàn)象。此外，藥敏結(jié)果中顯示肺炎克雷伯菌對亞胺培南、呋喃妥因及阿米卡星等抗生素高度敏感，提示碳青霉烯類及酶抑制劑復合藥物對肺炎克雷伯菌有較好的抗菌作用，可作為青霉素耐藥后的替代藥物使用。而對頭孢菌素耐藥率也較低，這可能與本院第三代頭孢菌素的規(guī)范化使用有關(guān)。

肺炎克雷伯菌最常見的耐藥機制是產(chǎn)ESBLs，水解青霉素及頭孢菌素類的抗生素，造成多藥耐藥，而ESBLs是β－內(nèi)酰胺酶中重要的一類。本研究顯示，近3年內(nèi)的產(chǎn)ESBLs株占臨床分離肺炎克雷伯菌的31.1%，與國內(nèi)其他地區(qū)分離的產(chǎn)ESBLs株相比偏低〔5，6〕，這種陽性率的差異與不同地區(qū)或不同醫(yī)院使用第三代頭孢菌素的種類、數(shù)量及時間不同而造成ESBLs的篩選及誘導不同有關(guān)。目前，發(fā)現(xiàn)的ESBLs依據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能主要包括TEM、SHV、鄰氯青霉素水解酶(OXA)、CTX－M 和其他一些少見類別〔7〕，根據(jù)氨基酸序列相似性又可以將CTX－M型ESBLs分為 3 個主要亞組〔8〕，分別為 CTX－M－1 型(CTX－M－1、CTX－M－3、CTX－M－10、CTX－M－15 及 CTX－M－23 等)，CTX－M－2 型(CTX－M－2、CT X－M－4、CTX－M－5、CT X－M－6、和 TOHO－1 等) 及CTX－M 9 型(CTX－M－9、CTX－M－13、CTX－M－14、CTX－M－19 及 TOHO－2等)。本研究結(jié)果表明鑒定出的14株ESBLs陽性菌株中，以CTX－M－14檢出率最高，占71.4%，TEM 型和SHV型其次，分別為50%和42.9%，此結(jié)果與深圳地區(qū)的檢測結(jié)果相似〔9〕。與過去研究的本社區(qū)大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs的亞型不同，本次檢測的肺炎克雷伯菌SHV型較多，而CTX－M－1型較少，從而反映了ESBLs在不同菌屬內(nèi)的偏向性。本研究還發(fā)現(xiàn)有92.9%的ESBLs陽性菌株中同時攜帶2種或以上的β－內(nèi)酰胺酶基因，含有多種β－內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌的耐藥譜一般都會拓寬，而且還能通過質(zhì)粒介導導致多重耐藥的傳播和流行。

隨著抗菌藥物的廣泛使用，不同地區(qū)和醫(yī)院因其使用抗菌藥物的不同，流行的ESBLs基因型也不盡相同，因此，了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌的耐藥情況及ESBLs基因型的資料，將有助于預測未來耐藥趨勢，從而指導臨床更合理地用藥。

1 劉行超，曾桂芬，賀 英.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及耐藥性分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學雜志，2010;20(3):430－2.

2 賴國祥，林慶安，黃梁滸，等.老年下呼吸道感染患者肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌耐藥性分析〔J〕.中華老年醫(yī)學雜志，2003;22(3):146－9.

3 陳玉玉，張秋桂，顏向軍.老年患者呼吸道感染病原菌分布及耐藥性監(jiān)測〔J〕. 中華醫(yī)院感染學雜志，2010;20(23):3804－5.

4 李 靜，鐘啟平.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及藥敏分析〔J〕. 天津醫(yī)科大學學報，2009;15(2):216－8.

5 郝維敏，秦淑國，王 維，等.宿州市大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的檢測及基因型分布〔J〕.臨床輸血與檢驗，2007;9(4):305－9.

6 黃 烈，韋潔宏，張銀輝，等.大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs表型與基因型分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學雜志，2009;19(1):17－20.

7 Bradford PA.Extended－spectrum beta－lactamases in 21st century:characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat〔J〕.Clin Microbiol Rev，2001;14(4):933－51.

8 Bonnet R.Growing group of extended－spectrum beta－lactamases:the CTX－M enzymes〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2004;48(1):1－14.

9 張阮章，盧月梅，胡玉華，等.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌呼吸道分離株的基因分型及耐藥性分析〔J〕.中國微生態(tài)學雜志，2010;22(7):646－8.