NF-κB與Caspase-9在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王 敏，程善光，季萬勝

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261031)

核因子-κB(NF-κB)是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的蛋白，在許多惡性腫瘤中均有高表達(dá)［1，2］，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Caspase-9是一種促凋亡因子，是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路中最重要的凋亡啟動因子，其活化能啟動級聯(lián)激活反應(yīng)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。2010年1月～2010年11月，我們采用免疫組化法檢測了NF-κB與Caspase-9在胃癌組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 同期行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的胃癌組織標(biāo)本68份(胃癌組)，患者男48例，女20例，年齡20～79歲，中位年齡59.5歲。根據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，低分化/Ⅲ級胃癌23例，高、中分化/Ⅰ、Ⅱ級胃癌45例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，有漿膜浸潤40例。患者術(shù)前均未行化療、放療和免疫治療。另取距離癌灶5 cm以上癌周正常組織作為癌旁組。

1.2 NF-κB、Caspase-9表達(dá)檢測 所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化法檢測NF-κB和Caspase-9表達(dá)。兔抗人Caspase-9抗體、兔抗人NF-κBp65抗體均購于武漢博士德公司，PV-9000二步法所用免疫組化檢測試劑及DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物科技有限公司，嚴(yán)格按說明書操作，用已知的陽性片做陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:NF-κB、Caspase-9陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和/或胞核染成棕褐色或棕黃色。隨機(jī)抽取有代表性的10個連續(xù)的高倍視野(×400倍)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，均值為該切片的積分值。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例進(jìn)行綜合評分。染色強(qiáng)度評分:無色為0分，淺黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分;陽性細(xì)胞百分比評分:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≤1分為陰性，≥2分者為陽性［4］。分析 NF-κB、Caspase-9 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及二者表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用 Fisher確切概率法和 χ2檢驗及Spearman等級相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB及 Caspase-9表達(dá) 胃癌組及癌旁組NF-κB 陽性率分別為 63.2%(43/68)、33.3%(23/68);Caspase-9陽性率分別為 36.8%(25/68)、80.9%(55/68)，P 均 ＜0.05。

2.2 NF-κB和Caspase-9表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 NF-κB和Caspase-9表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 NF-κB、Caspase-9在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性胃癌組NF-κB表達(dá)陽性的43例組織中Caspase-9蛋白表達(dá)陽性11例，25例陰性表達(dá)NF-κB的組織中14例Caspase-9蛋白表達(dá)陽性，經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，NF-κB和Caspase-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.304，P=0.025)。

3 討論

NF-κB是調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［5］。其激活最常見的形式為p50和p65組成的二聚體，在非激活條件下，NF-κB與抑制因子IκB相結(jié)合而處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)等多種刺激時，IκB發(fā)生磷酸化和泛素化并隨后降解，NF-κB被激活并與IκB分離，活化的NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，定位于細(xì)胞核而不能返回胞質(zhì)，與靶基因上啟動子或增強(qiáng)子的κB基因序列發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控一系列腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成與局部浸潤［6］。通常認(rèn)為，NF-κB在癌癥的早期事件中通過刺激惡性細(xì)胞生長參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而促進(jìn)癌癥的發(fā)生;在癌癥晚期發(fā)展中，NF-κB作為調(diào)節(jié)因子也發(fā)揮一定作用，如NF-κB可上調(diào) COX-2、MMP-7表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移［7］。Sasaki等［8］對胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組化和RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)NF-κB的活性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腹膜轉(zhuǎn)移、腫瘤體積等臨床病理特點有關(guān)，與胃癌患者的存活時間呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明，NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌的組織學(xué)分型、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即隨著分化減低、浸潤深度的增加體積，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，NF-κB的表達(dá)明顯升高，此與Sasaki等報道的結(jié)果相符，說明NF-κB能夠促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，并可以對胃癌的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。

Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，通常情況下以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，在細(xì)胞線粒體依賴的凋亡傳導(dǎo)途徑中，Caspase-9屬于啟動型Caspase，位于細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路的上游，當(dāng)?shù)蛲銎鹗夹盘栕饔糜诰€粒體后，引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)結(jié)合并使其構(gòu)象改變形成活性復(fù)合體，后者與Caspase-9結(jié)合并誘導(dǎo)其發(fā)生自身活化，活化后又能激活下游的Caspase因子，啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由于Caspase可以自我活化并能夠相互激活，因此凋亡過程一旦觸發(fā)，即呈級聯(lián)放大效應(yīng)。Park等［9］研究 MMC介導(dǎo)的SUN-16人胃癌細(xì)胞株凋亡時發(fā)現(xiàn)，Caspase-9在腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。Caspase-9蛋白低表達(dá)時細(xì)胞凋亡受到抑制的機(jī)制可能是Caspase-9蛋白表達(dá)下降，其激活下游Caspase因子的能力降低，從而使細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞凋亡和增殖平衡被打破，胃癌則可能發(fā)生。本研究結(jié)果表明，Caspase-9在胃癌組織中的表達(dá)率明顯低于癌旁組，且分化程度越差其表達(dá)率越低，但與浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。表明Caspase-9表達(dá)與胃癌的惡性程度有關(guān)，Caspase-9是正常分化細(xì)胞所具有的，正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中易失去某些表型，因而我們認(rèn)為Caspase-9隨著分化降低而表達(dá)減少，是腫瘤異常分化的結(jié)果。

本研究還發(fā)現(xiàn)NF-κB和Caspase-9在胃癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。說明NF-κB能夠通過某種途徑抑制Caspase 9的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡?？梢哉J(rèn)為胃癌細(xì)胞在NF-κB的作用下增殖、分化乃至轉(zhuǎn)移，在此過程中，Caspase-9作為影響細(xì)胞凋亡的過程因子，也起著不可或缺的作用。

總之，胃癌組織中存在 NF-κB高表達(dá)及Caspase-9低表達(dá)，且 NF-κB對 Caspase-9具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可以進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，共同促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步深入研究兩種因子與胃癌的關(guān)系，可為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

［1］Sethi G，Sung B，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B activation:from bench to bed side［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):21-31.

［2］Ng CS，Novick AC，Tannenbaum CS，et al.Mechanisms of immune evasion by renal cell carcinoma:tumor-induced T-lymphocyte apoptosis and NF kappaB suppression［J］.Urology，2002，59(1):9-14.

［3］Green DR，Reed JC，Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281(5381):1309-1312.

［4］Romieu-Mourez R，Landesman-Bollag E，Seldin DC，et al.Roles IKK kinases and protein kinase CK2 in activation of nuclear factorκB in breast cancer［J］.Cancer Res，2001，61(9):3810-3818.

［5］Loercher A，Lee TL，Ricker JL，et al.Nuclear factor-kappa B is an important modulator of the altered gene expression profile and malignant phenotype in squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res，2004，64(18):6511-6523.

［6］Bharti AC，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B and cancer:its role in prevention and therapy［J］.Biochem Pharmacol，2002，64(5-6):883-888.

［7］Yu HG，Zhong X，Yang YN.Increased expression of nuelear factorkappaB is correlated with tumor angiogenesis in human colorectal cancer［J］.int J Colorectal Dis，2004，19(l):18-22.

［8］Sasaki N，Morisaki T，Hashizume K，et al.Nuclear factor-kappa B p65(RelA)translation factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue［J］.Clin Cancer Res，2001，7(12):4136-4142.

［9］Park JC，Park MJ，Hwang CS，et al.Mitomycin C induces apoptosis in a caspases-dependent and Fas/CD95-independent manner in human gastric adenocarcinoma cells［J］.Cancer Lett，2000，158(2):125-132.