秦皮乙素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的影響及機(jī)制探討

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000)

秦皮是具有很大開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的地道中藥材，其主要成分為香豆素類化合物，其中秦皮乙素在秦皮中含量為0.126% ～1.738%［1］。研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙秦在體外對(duì)A549肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、人T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞以及人胃癌細(xì)胞等均有抑制作用，可促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡;其在體內(nèi)外對(duì)鼠類的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用可能是其體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制之一［2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721有促凋亡作用，但其對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。2010～2011年，我們觀察了秦皮乙素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2體外增殖的影響，旨在為該藥進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細(xì)胞(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)。秦皮乙素(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào):110741-200506)，5-氟脲嘧啶(5-Fu，天津金耀氨基酸藥業(yè)，10 mL:0.25 g，批號(hào):20101205)。兔抗人Bax抗體(SANTA CRUZ公司，型號(hào):SC-526)，兔抗人 Bcl-2抗體(SANTA CRUZ公司，型號(hào):SC-429)。兔抗人Caspase-9抗體(博奧森公司，型號(hào):BS-0049R)。兔抗人Caspase-3抗體(博奧森公司，型號(hào):BS-0081R)。Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1，碧云天生物技術(shù)研究所);Annexin V-FITC凋亡試劑盒(北京寶賽生物公司);胰蛋白酶(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季清生物制品公司);DMEM培養(yǎng)基干粉(GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(Amresco公司)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光顯微鏡(LEICACTR4000，德國(guó))，XD-101型倒置顯微鏡(OLYMPUS TOKYO JAPAN)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCaLibur)，YG-875B無(wú)菌超凈工作臺(tái)(上海醫(yī)療器械廠)，CO2培養(yǎng)箱(Sheldon Manufacturing IncUSA)，酶標(biāo)儀(9602A，北京普朗)，IBO X600活體成像系統(tǒng)(USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞 HepG2培養(yǎng)于含15%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2傳代培養(yǎng)，每2～3天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于96孔板，分為對(duì)照組、5-Fu組及秦皮乙素組。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)對(duì)照組不干預(yù)，5-Fu組予0.77 mmol/L的5-Fu干預(yù)，秦皮乙素組分別予 0.56 、1.12、2.24、4.48、8.96 mmol/L 的秦皮乙素干預(yù)［3］，每組5個(gè)平行復(fù)孔。干預(yù)后培養(yǎng)24 h。細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)采用MTT比色法，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 對(duì)照組不干預(yù)，5-Fu組予濃度為0.77 mmol/L的5-Fu干預(yù)，秦皮乙素組分別予2.24、4.48 mmol/L的秦皮乙素干預(yù)。干預(yù)后培養(yǎng)24 h，0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞后1 000 g離心5 min，加入195 μL Annexinv-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細(xì)胞儀Bioconsort專用軟件處理計(jì)算細(xì)胞凋亡率［3］。

1.2.4 細(xì)胞干預(yù)及線粒體膜電位檢測(cè) 對(duì)照組不干預(yù)，5-Fu組予濃度為0.77 mmol/L的5-Fu干預(yù)，秦皮乙素組分別用 1.12、2.24、4.48 mmol/L 的秦皮乙素干預(yù)。干預(yù)后培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞儀綠色熒光法測(cè)定細(xì)胞百分率，即線粒體膜電位［4］。

1.2.5 細(xì)胞干預(yù)及Caspase酶活性檢測(cè) 細(xì)胞干預(yù)同1.2.4，分光光度法檢測(cè)Caspase酶活性。收集細(xì)胞后600 g、4℃離心5 min，小心吸除上清，PBS洗滌1次。冰浴裂解細(xì)胞15 min。96孔板中每孔加入檢測(cè)緩沖液 60 μL，待測(cè)樣品30 μL，底物 Ac-IETD-ρNA10 6 mL，37 ℃孵育 3 h，405 nm 處測(cè)定樣品吸光值，樣品吸光值減去對(duì)照組吸光值即為樣品中Caspase催化產(chǎn)生ρNA的吸光度值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 Caspase 3、Caspase 8，Caspase 9 活性［5］。ρNA標(biāo)準(zhǔn)曲線制定:按照40 μL裂解液加入60 μL檢測(cè)緩沖液的比例配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為 0、10、20、50、100、200 μmol/L，每個(gè)濃度取 100 μL用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去不含ρNA的空白對(duì)照的A405，計(jì)算出實(shí)際因ρNA而導(dǎo)致的吸光度，并制作出ρNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 細(xì)胞干預(yù)及 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達(dá)測(cè)定 蓋玻片先行防脫片處理(二甲苯12 h，丙酮3 h，無(wú)水乙醇24 h，70%乙醇30 min，雙蒸水煮1 h);載玻片事先泡酸24 h;六孔板做細(xì)胞爬片。細(xì)胞分組及干預(yù)同1.2.3。干預(yù)后培養(yǎng)48 h，10%福爾馬林固定30 min，PBS洗3次，30%H2O2和甲醇混合，室溫浸泡15 min，蒸餾水洗3次，滴加3%BSA封閉液25 min，加入1∶500稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。加入1∶200稀釋的二抗，37℃避光孵育20 min，封片。免疫熒光法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達(dá):采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行處理分析，自動(dòng)計(jì)算出平均熒光強(qiáng)度。計(jì)算公式:圖片的像素面積(像素)×圖片平均光密度(光強(qiáng)度/像素)/AOI像素面積(像素)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞增殖抑制率比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較(n=5，±s)

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較(n=5，±s)

注:與對(duì)照組比較，★P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 OD值 抑制率(%)5-Fu 組 0.512 ±0.09★37秦皮乙素組0.56 mmol/L 0.715 ±0.11★ 12 1.12 mmol/L 0.577 ±0.04★ 29 2.24 mmol/L 0.463 ±0.18△ 43 4.48 mmol/L 0.358 ±0.12△ 56 8.96 mmol/L 0.252 ±0.06△ 69對(duì)照組0.813 ±0.16 0

2.2 細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞凋亡率比較見(jiàn)表2。

2.3 線粒體膜電位 各組細(xì)胞膜電位比較見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，隨秦皮乙素作用濃度增加，HepG2細(xì)胞線粒體膜電位下降，呈濃度依賴性。

2.4 Caspase酶活性 不同濃度秦皮乙素處理24 h后，Caspase 3、Caspase 9活性增高，Caspase 8活性無(wú)明顯變化。ρNA濃度相當(dāng)于 A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Caspase 3:Y=0.0051X+0.0484，R2=0.9948;Caspase 8:Y=0.0034X+0.0374，R2=0.99434;Caspase 9:Y=0.0037X+0.03，R2=0.9905。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較(n=5，%，±s)

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較(n=5，%，±s)

注:與對(duì)照組比較，★P ＜0.01

組別 凋亡率5-Fu 組 15.24 ±0.41★秦皮乙素組2.24 mmol/L 17.39 ±0.67★4.48 mmol/L 26.12 ±0.59★對(duì)照組1.15 ±0.052

表3 各組細(xì)胞膜電位比較(n=5，%，±s)

表3 各組細(xì)胞膜電位比較(n=5，%，±s)

注:與對(duì)照組比較，★P ＜0.01

組別 線粒體膜電位5-Fu 組 21.37 ±0.28★秦皮乙素組1.12 mmol/L 15.76 ±0.71★2.24 mmol/L 34.92 ±0.34★4.48 mmol/L 46.32 ±0.21★對(duì)照組0.09 ±0.04

2.5 Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達(dá) 見(jiàn)表4。

表 4 各組 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達(dá)(n=5， ±s)

表 4 各組 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達(dá)(n=5， ±s)

注:與對(duì)照組比較，★P ＜0.01;與2.24 mmol/L 比較，△P ＜0.05

組別Bax Bcl-2 Caspase-9 5-Fu 組 117.62 ±5.16★ 96.15 ±3.86★ 100.67 ±2.48★秦皮乙素組2.24 mmol/L 139.71 ±10.52★ 110.9 ±8.76★ 124.57 ±6.14★4.48 mmol/L 165.67 ±3.74★△ 98.27 ±3.94★△ 145.61 ±3.95★△對(duì)照組83.14 ±3.25 159.21 ±5.48 63.01 ±5.14

3 討論

中藥誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是一個(gè)新興的課題，揭示其作用機(jī)制、篩選抗腫瘤新藥為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)途徑有膜受體通路和線粒體通路，它們之間既相互聯(lián)系又相對(duì)獨(dú)立，Caspase等蛋白酶水解系統(tǒng)是凋亡過(guò)程的核心。膜受體通路可形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，引起Caspase-8聚集，再作用于Caspase-3引起細(xì)胞凋亡;線粒體通路為線粒體膜電位改變，可釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-9及Caspase-3引起細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的首要事件，一旦線粒體跨膜電位發(fā)生變化，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。在線粒體凋亡通路中，線粒體是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件，線粒體膜的完整性由線粒體跨膜電位來(lái)維持，跨膜電位降低時(shí)，膜的通透性改變，引起細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)，秦皮乙素可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，呈劑量依賴性;表明秦皮乙素可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌 HepG2 細(xì)胞凋亡［6～8］。

Caspase-9和Caspase-3是線粒體凋亡通路中兩個(gè)重要的Caspase分子。Caspase-9是線粒體凋亡通路中上游凋亡起始的重要信號(hào)分子，活化的Caspase-9激活其下游的Caspase-3，而對(duì)Caspase-8無(wú)激活作用。Caspase-3活性增高繼而引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示，秦皮乙素作用24 h后，Caspase-9和Caspase-3活性增高，而Caspase-8的活性無(wú)明顯變化;免疫熒光法結(jié)果顯示，Caspase-9表達(dá)增強(qiáng)。進(jìn)一步證實(shí)秦皮乙素可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［9］。

Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡過(guò)程中兩個(gè)重要的凋亡調(diào)控因子。Bax主要分布于線粒體外膜上，其過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Bcl-2是抗凋亡因子，當(dāng)Bax表達(dá)量高時(shí)，形成同源二聚體Bax/Bax，抑制Bcl-2的抗凋亡作用從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Bax表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí) Bcl-2的表達(dá)明顯減弱［10，11］。

分析本研究結(jié)果，秦皮乙素可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。但尚需通過(guò)進(jìn)一步研究驗(yàn)證下述問(wèn)題:在 Caspase-9抑制劑或Caspase-3抑制劑的作用下細(xì)胞是否仍然會(huì)發(fā)生凋亡;秦皮乙素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否還有其它途徑;秦皮乙素對(duì)其它信號(hào)通路和癌基因、抑癌基因是否有影響等。

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