手工密閉式制備冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞方法研究

王萬(wàn)仲

(紅河州中心血站 云南蒙自 661100)

血液的深低溫保存已經(jīng)取得了較好的臨床應(yīng)用效果,甘油作為細(xì)胞內(nèi)低溫保護(hù)劑,保證了紅細(xì)胞在深低溫環(huán)境下不易溶血。紅河州中心血站自2009年開(kāi)展了紅細(xì)胞的冷凍保存工作,最初在無(wú)菌室開(kāi)放式操作,存在細(xì)菌污染血液的風(fēng)險(xiǎn)。紅細(xì)胞甘油化時(shí)采用來(lái)回式振蕩器混合搖勻,解凍洗滌時(shí)用羥乙基淀粉洗滌法[1]洗滌,但上述方法耗時(shí)間、耗人力、溶血率高,效果不理想,難以滿足臨床緊急用血的需要。據(jù)此,筆者參考美國(guó)ACP215全自動(dòng)細(xì)胞洗滌機(jī)的方法[2],使用無(wú)菌接合機(jī)無(wú)菌接駁在密閉環(huán)境下手工制備冰凍紅細(xì)胞及解凍復(fù)蘇洗滌,取得了滿意的效果,最終制品的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果符合中華人民共和國(guó)全血及成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

復(fù)方甘油溶液,規(guī)格160mL,Rh(-)懸浮紅細(xì)胞,一次性200mL轉(zhuǎn)移袋,分漿夾,一次性輸血器,一次性使用單采血細(xì)胞分離器800mL轉(zhuǎn)移袋,9%Nacl溶液,規(guī)格80mL,三聯(lián)袋0.9%Nacl溶液,規(guī)格750mL。

1.2 設(shè)備

水平旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞混合搖床,恒溫循環(huán)水溶箱,無(wú)菌接合機(jī),-70℃以下專用低溫冰箱,大型低溫離心機(jī)。

2 操作方法

2.1 紅細(xì)胞甘油化

2.1.1 分上清 懸浮紅細(xì)胞用無(wú)菌接合機(jī)接駁一個(gè)200mL一次性轉(zhuǎn)移袋,稱量平衡置于CR7離心機(jī)中,3000rpm離心10min,在分夾中分離出上清液,得壓積紅細(xì)胞,用塑料止流夾夾住連通管路,搖勻得壓積紅細(xì)胞。

2.1.2 加注甘油 按照懸浮紅細(xì)胞標(biāo)識(shí)量1、1.5、2u分別加入復(fù)方甘油溶液160、240、320mL。具體操作方法:將復(fù)方甘油溶液袋的游離管路和輸血器入口端的管路無(wú)菌接合、懸浮紅細(xì)胞袋的游離管路和輸血器出口端管路無(wú)菌接合,通過(guò)輸血器滴速控制滾輪控制甘油滴速向血袋內(nèi)緩慢注入復(fù)方甘油溶液,血袋放置在水平旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞混合搖床上混勻,加注前5min滴速不超過(guò)3mL/min,5min后滴速增加到4～6mL/min,加注完畢室溫下水平靜置30min以上。

2.1.3 分離多余的甘油 甘油化的紅細(xì)胞稱量平衡,2000rpm離心5min,分漿夾中分離出未進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)多余的甘油轉(zhuǎn)移入200mL轉(zhuǎn)移袋內(nèi),熱合、斷袋。

2.1.4 倒袋 將甘油化紅細(xì)胞袋游離管路和一次性使用單采血細(xì)胞分離器800mL轉(zhuǎn)移袋游離管路無(wú)菌接駁,紅細(xì)胞倒入800mL轉(zhuǎn)移袋內(nèi),熱合、斷袋,電腦登記入庫(kù)打印血袋流水號(hào)標(biāo)簽粘貼。

表1 冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果(n=31,s)

表1 冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果(n=31,s)

紅細(xì)胞回收率(%)31 81.66±2.33 ≥80上清液甘油含量(g/L)31 1.93±0.49 ≤10殘余白細(xì)胞(%)31 0.85±1.21 ≤1殘余血小板(%)31 0.63±0.24 ≤1上清液游離血紅蛋白含量(g/L)31 0.32±0.18 ≤1體外溶血率(%)31 16.33±4.48 ≤50

2.1.5 冰凍保存 甘油化紅細(xì)胞放入特制防護(hù)紙盒內(nèi),立即放入-50℃速凍機(jī)進(jìn)行速凍,速凍完畢立即放入-65℃以下深低溫冰箱保存,得冰凍紅細(xì)胞。

2.2 冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞制備

2.2.1 復(fù)蘇解凍 從冰箱中取出冰凍紅細(xì)胞去除外包裝盒,直接放入39℃循環(huán)水溶箱中解凍,溶解時(shí)雙手水平勻速搖動(dòng)血袋,溶解完畢,室溫水平靜置5min,留取一根試管血作為質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)本。

2.2.2 第1次洗滌 血袋游離管路和9%NaCl溶液游離管路無(wú)菌接駁,向血袋內(nèi)注入9%NaCl溶液,1、1.5、2u分別注入80、140、160mL,滴速為80ml/min,血袋置于水平旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞混合搖床上邊注邊搖勻,注完后熱合、斷袋,水平靜置5min。無(wú)菌接駁一套三聯(lián)袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min注入0.9%的NaCl350mL,邊注邊搖勻,注完后水平靜置5min,以3000rpm離心10min,分漿夾中去上清液。

2.2.3 第2次洗滌 以80mL/min向血袋內(nèi)注入0.9%NaCl400mL,邊注邊搖勻,注完后水平靜置5min,以3000rpm離心,分漿夾中去上清液,熱合、斷袋。

2.2.4 第3次洗滌 無(wú)菌接駁一套三聯(lián)袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min向血袋內(nèi)注入0.9%NaCl150mL,邊注邊搖勻,以3000rpm離心10min,分漿夾中去上清液。

2.2.5 第4次或4次以上洗滌 按照2.2.4方法操作,直至離心后上清液清亮為止。

2.2.6 冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞制品 洗滌后的紅細(xì)胞加入0.9%NaCl溶液懸浮,1、1.5、2u最終容量分別為(200±20)、(300±30)、(400±40)mL,搖勻,留取一根試管血作為質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)本,使用搟血鉗將紅細(xì)胞逆流至血袋塑料管內(nèi),熱合5cm長(zhǎng)兩段血作配血標(biāo)本,電腦登記入庫(kù)打印血袋標(biāo)簽粘貼,得解凍去甘油紅細(xì)胞制品,包裝好供應(yīng)臨床。

2.3 數(shù)據(jù)檢測(cè)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)紅細(xì)胞回收率、殘余白細(xì)胞、殘余血小板,Trinder法檢測(cè)上清液游離血紅蛋白含量及體外溶血率,過(guò)碘酸鈉法檢測(cè)上清液甘油含量。

3 結(jié)果

共制備解凍去甘油紅細(xì)胞31袋計(jì)51u,其質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。所有血液全部供應(yīng)臨床,共計(jì)30多人次輸血,經(jīng)輸血后觀察無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生,無(wú)血紅蛋白尿、腎功能受損等,取得良好的臨床效果(表1)。

4 討論

紅細(xì)胞在甘油化及解凍去甘油的過(guò)程是影響紅細(xì)胞溶血最為關(guān)鍵的因素,如何在制備過(guò)程中保證血液質(zhì)量,同時(shí)簡(jiǎn)化操作流程是廣大血液工作者追求的目標(biāo)。紅細(xì)胞甘油化時(shí),筆者使用的是利用輸血器嚴(yán)格控制甘油滴速,加注時(shí)采取先慢后快的原則,縮小細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡時(shí)間,再使用水平旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞混合搖床代替來(lái)回式振蕩器混勻血袋,保證甘油進(jìn)入血袋內(nèi)迅速擴(kuò)散,大大降低了甘油進(jìn)入血袋內(nèi)由于高滲透壓導(dǎo)致的細(xì)胞膜破裂溶血;在解凍洗滌去甘油時(shí),筆者采用兩種梯度的鹽水洗滌、平衡靜置等使紅細(xì)胞緩慢從高滲到等滲狀態(tài)的轉(zhuǎn)變,有效降低了滲透壓梯度的急劇變化引起的紅細(xì)胞溶血;此外,整個(gè)洗滌過(guò)程中筆者均使用無(wú)菌接合機(jī)接駁各種溶液袋子之間的連通,保證血液在全封閉環(huán)境下制備,防止了在無(wú)菌室開(kāi)放式制備細(xì)菌污染的機(jī)會(huì),整個(gè)制備過(guò)程只需由一位工作人員操作。終產(chǎn)品經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果證實(shí)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),尤其適合中小型血站、偏遠(yuǎn)地區(qū)血站的開(kāi)展,值得大力推廣應(yīng)用。

[1]徐國(guó)泰,呂秋霜,王春榮,等.羥乙基淀粉溶液洗滌法—快速洗滌冷凍紅細(xì)胞[J].中國(guó)輸血雜志,1988,1(4):191.

[2]金志堅(jiān),王擁軍,徐芳,等.細(xì)胞洗滌機(jī)去甘油化技術(shù)的應(yīng)用[J].中國(guó)輸血雜志,2006,19(1):55.

[3]中化人民共和國(guó).國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB18469-2001.全血及成分血質(zhì)量要求[S].北京:中國(guó)醫(yī)療出版社,2002:7～8.