肉牛大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體混合感染的診斷與分析

彭清潔 王 沖 胡長敏 陳穎鈺 晁 金 聞曉敏 姜 鵬 郭愛珍 ，3，4**

1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；4.國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室，武漢 430070；5.武漢科前動物生物制品有限責任公司，武漢 430070；6.武漢海康爾牧業(yè)有限公司，武漢 430070；7.武漢市蔡甸區(qū)畜牧獸醫(yī)局，武漢 430100

湖北天門某肉牛養(yǎng)殖場2012年4月初從長春營城子購入一批250kg左右的西雜牛，自購入15d左右肉牛開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、拉血便和血尿、呼吸急促、關(guān)節(jié)腫大、體溫升高及精神沉郁。根據(jù)牛場主的介紹，結(jié)合相關(guān)文獻報道資料，初步判定是長時間運輸，導致犢牛遭受擁擠、饑渴、強噪音等一系列環(huán)境因素應激，致使犢牛發(fā)病。為確診病因，本試驗對病牛進行剖檢取樣、致病菌常規(guī)分離純化、病原菌16sRNA鑒定和小鼠攻毒試驗。對心臟和腎臟組織樣品制作病理切片并觀察，可見心肌充血、出血及心肌纖維細胞變性壞死，腎臟淤血、水腫、腎小管變性壞死。

1 材料與方法

1.1 樣品

無菌采集病死牛心、肝、脾、肺和腎組織各1份。將采集的各臟器組織塊放入10%的福爾馬林溶液中固定（固定液的用量是采集組織病料的15倍），備用。

1.2 培養(yǎng)基

李斯特菌（LuriaBertani，LB）液體培養(yǎng)基：稱量胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl10g，溶解于ddH2O中；待其完全溶解后，再用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，定容至1000mL；然后高壓蒸汽滅菌20min，室溫保存，備用。

胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticsoyBroth，TSB）培養(yǎng)基，批號1091999，美國碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

胰蛋白胨大豆瓊脂（TrypticSoyAgar，TSA）培養(yǎng)基，批號1074969，美國碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號120514，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，批號20110511-01，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

支原體（Pleuropneumonia-LikeOrganisms，PPLO）固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基用于牛支原體的分離培養(yǎng)，配制所用肉湯粉、瓊脂粉等均由BD公司生產(chǎn)，參考文獻資料進行配制，但未加1%醋酸鉈溶液。TSA、TSB購自上海生工生物工程有限公司，麥康凱購自杭州天和微生物試劑有限公司。

水培酪蛋白（M-H）瓊脂培養(yǎng)基，批號20110511，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 藥敏紙片

青霉素、強力霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、克林霉素、恩諾沙星、頭孢氨芐、林可霉素、慶大霉素、新霉素、阿奇霉素、鏈霉素、先鋒必和紅霉素13種常用藥敏試紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號為201108，-20℃密閉保存。

1.4 實驗動物

6只SPF設雌性昆明鼠，3周齡，體重20～25g，購于湖北省疾控中心。購買后，給予充足的飼料和飲水，按照相關(guān)實驗動物飼養(yǎng)規(guī)程進行飼養(yǎng)。5只小鼠隨機分配，分別注射從病牛心、肝、脾、肺、腎得到的組織物培養(yǎng)菌液，另1只用于設置對照，注射等量生理鹽水。

1.5 試驗方法

1）細菌的分離與純化。無菌操作，在無菌操作臺上，用消毒后的接種環(huán)穿刺所采集的心、肝、脾、肺、腎典型病變處，將采集好的病料劃線接種在TSA培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后分別觀察各培養(yǎng)基上生長菌落的顏色、形狀和大小等情況。

2）細菌的PCR鑒定。采用設計的引物，以細菌DNA為模板，進行PCR擴增試驗和鑒定。

①細菌DNA模板的制備。將分離純化后的細菌菌株接種至TSB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。取150μL過夜培養(yǎng)菌液，放入Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min離心 30s，取上清液作為DNA模板。

②擴增。16SrRNA通用引物序列為；16Sr-RNA-forward:5'-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3'、16SrRNA-reverse:5'-CGCGGATCCGCrACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應體系為50μL， 其 中 2×Taq Mixture（Tiangen）2.5μL，Primers（10μmol/L）各 2.0μL，DNA 模板 7.5μL，去離子水13.5μL。

PCR反應程序如下：94℃預變性 10min后，94℃變 性 1min，55℃10min 退火 1min，72℃延 伸1min，30 個循環(huán)后，72℃延伸 10min。

3）牛支原體的分離與鑒定。無菌取小塊的肺組織樣品，涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面，于含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時將小塊組織樣品投入到PPLO液體培養(yǎng)基中，2～3d后，用光學顯微鏡低倍鏡觀察菌落形態(tài)，支原體在固體培養(yǎng)基上應具有“煎蛋樣”特征，液體培養(yǎng)基由紅色變黃色且透亮。

無菌操作，在無菌操作臺上，用無菌牙簽挑取牛支原體菌落于預加入150mL滅菌水的Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min離心 30s，然后取上清液作為DNA模板。利用牛支原體特異性引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T（寶生物工程大連有限公司）中，委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行序列測定。

牛支原體的特異性引物如下：SCl:5'-ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3'、SC2:5'-CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3'。

PCR反應體系為20μL，其中：2×TaqMixture（Tiangen）10μL，引物 SCl和 SC2（10μmol/L）各1.0μL，支原體DNA模板1.0μL，去離子水7.0μL。

表1 試驗用抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標準

PCR反應程序：94℃預變性 5min，94℃變性45s，57℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)后，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物預期大小為277bp。

4）藥敏試驗。采用瓊脂紙片擴散法（K-B法）進行藥物敏感性試驗。所用培養(yǎng)基為水解酪蛋白（M-H）瓊脂培養(yǎng)基，所用的藥敏紙片有青霉素G（10μg/片）、強力霉素（30μg/片）、環(huán)丙沙星（5μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、克林霉素（2μg/片）、恩諾沙星（5μg/片）、頭孢氨芐（30μg/片）、林可霉素（2μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、新霉素(30μg/片)、先鋒必（75μg/片）和紅霉素（15μg/片）13種常用藥敏試紙片。運用瓊脂紙片擴散法來測定分離到的細菌菌株對所選用的抗菌藥物試紙片藥物的敏感性。判斷標準見表1。

5）病理切片、HE染色。病料取樣：主要取病變心臟組織，取幾塊相同大小的組織塊，放入液氮管，-80℃保存；取腎臟組織用4℃ 4%中性多聚甲醛溶液固定。選取的組織材料，厚度2～4mm，面積1.5～3.0cm×2.0cm為宜，一方面利于組織塊迅速固定，另一方面便于盡可能全面觀察病變。常規(guī)HE染色：固定好后，脫水，透明，石蠟包埋，制備4μm厚切片，常規(guī)HE染色。觀察并采圖：在光學顯微鏡下觀察所制作的切片并采圖。

6）小鼠攻毒試驗。待培養(yǎng)的細菌菌株活化以后以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接到盛有5mLTSB的細菌瓶中，37℃搖床中震蕩培養(yǎng)至OD值達到2.7左右（約4h）時開始處理細菌。

先取1mL菌液于1.5mLEP管中，8000r/min離心4min，用生理鹽水洗滌懸垂2次，之后轉(zhuǎn)入到盛有9mL生理鹽水的瓶中，再以1∶10的比例稀釋，一共得到3個梯度的菌液。

5只3周齡雌性昆明鼠，取過夜菌液200μL，注射小鼠腹腔內(nèi)，對照組小鼠注射等量的生理鹽水。其中注射有肺部細菌（天門）培養(yǎng)液的小鼠24h內(nèi)死亡，注射有氣管內(nèi)細菌（天門）培養(yǎng)液的小鼠48h內(nèi)死亡。解剖致死的小鼠，分別取其心、肝、脾、肺、腎接種分菌，PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床鑒定結(jié)果

圖1 病牛肺充血、出血、呈現(xiàn)肉變

圖5 脾縮水、出現(xiàn)褶皺

圖6 心臟充血、出血

根據(jù)病牛的臨床癥狀及牛場主口述的情況來看，病牛很可能是由于長時間的長途運輸使其產(chǎn)生應激，不適應新環(huán)境導致發(fā)病，初步診斷為運輸應激綜合征。臨床上，病牛表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、呼吸急促、關(guān)節(jié)腫大及精神沉郁。剖檢可見牛肺充血、出血、呈現(xiàn)肉變，肺切面鈍圓呈暗紅色；支氣管有明顯白色泡狀物；關(guān)節(jié)腫大；脾縮水、表皮皺縮；心臟充血、出血，心腔內(nèi)有暗紅色積血（如圖1～6所示）。推測病牛有呼吸系統(tǒng)疾病。

2.2 細菌初步鑒定結(jié)果

在PPLO牛支原體專用培養(yǎng)基上，菌落生長良好，所有菌落呈典型的“油煎蛋狀”；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有紅色菌落生成，形成圓形凸起，邊緣整齊、光滑菌落，直徑約2～3mm；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上，有黑色帶金屬閃光的菌落。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗結(jié)果 mm

由表2可知，從該病牛病變組織中分離得到的細菌和支原體對本試驗中所用的常見藥敏紙片的耐藥性較嚴重；大腸桿菌、志賀氏菌僅對新霉素敏感，對其他抗生素不敏感；牛支原體對環(huán)丙沙星、恩諾沙星敏感，對其他抗生素不敏感。

2.4 PCR擴增鑒定結(jié)果

對16SrRNA擴增產(chǎn)物進行測序分析，用BLAST軟件進行序列同源性比較。結(jié)果表明：“油煎蛋狀”菌落為牛支原體，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生成的紅色菌落為大腸桿菌；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上黑色帶金屬閃光的菌落為志賀氏菌。

2.5 病理切片、HE染色結(jié)果

本試驗將之前采集好的儲存在10%福爾馬林溶液中固定的病牛的心、肝、脾、肺和腎組織做了常規(guī)的石蠟切片，并且進行了HE染色，在光學顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示病牛不同的組織器官有不同的病理變化，心、腎表現(xiàn)得尤為明顯。其中，心肌充血、出血，心肌纖維細胞變性壞死；腎淤血、水腫、腎小管變性壞死。

圖7 心肌病變組織的組織病理學觀察（HE染色，400×）

圖8 淤血、水腫、腎小管變性壞死（HE染色，400×）

圖9 小鼠剖檢病變組織病理變化

2.6 小鼠攻毒試驗結(jié)果

小鼠攻毒試驗表明：病牛肺組織細菌培養(yǎng)液的毒力最強，注射的小鼠24h內(nèi)死亡，剖檢可見肺充血、出血、肺泡內(nèi)有少量漿液性滲出物；其次是氣管細菌培養(yǎng)液，注射的小鼠48h內(nèi)死亡，剖檢可見小鼠肝淤血、腸絨毛膜損壞如圖9所示。撲殺小鼠后，無菌采集心臟血進行細菌的分離和PCR鑒定，確認其與牛肺中分離到的大腸桿菌和志賀氏菌一致。因此可以確診病牛發(fā)生了大腸桿菌和志賀氏菌的混合感染。

3 討論

3.1 臨床診斷

正常的運輸也會產(chǎn)生許多應激，主要的應激源是供水不足、擁擠、微生物影響、飼料影響等，其他如運輸前后飼養(yǎng)場地和環(huán)境變化、閹割、驅(qū)蟲等一些處理辦法，也會給牛造成應激，所有的這些應激都可能影響到牛對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。而環(huán)境、應激、營養(yǎng)3者之間又存在著一定的聯(lián)系。所以必須考慮選擇最大限度的發(fā)揮家畜生產(chǎn)性能的最合理的管理設施。

3.2 細菌鑒定

本試驗對牛場主送檢樣品進行實驗室檢測，綜合判斷病牛為大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體混合感染。

牛大腸桿菌病是致病性大腸桿菌引起的、主要在新生犢牛中發(fā)生的急性傳染病，其最主要特征表現(xiàn)為敗血癥和劇烈的腹瀉，嚴重時可導致病牛脫水死亡。一般情況下，成年牛發(fā)病不致死。

目前，傳染性牛支原體肺炎已被認為是育肥牛、犢牛等的呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因，同時，也是引發(fā)肉牛運輸應激綜合征的主要病因。牛支原體常與細菌、病毒等共同作用，再加上一些環(huán)境因子（如天氣突變、通風不良、擁擠等），更會加劇病情。臨床上用多種抗生素進行治療，但效果不理想。該病例中，發(fā)病牛均為犢牛，且4月初剛從長春營城子運至湖北天門不久，北牛南運以及飼養(yǎng)條件改變等均可為支原體病的發(fā)生提供有利條件，而伴隨的細菌混合感染，更加導致病情復雜化。

志賀氏菌是由志賀氏菌引起的一種傳染病。志賀氏菌可以分成痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌4個血清群（種）。其中痢疾志賀氏菌感染最為嚴重，宋內(nèi)氏志賀氏菌引起的感染一般比較輕，福氏志賀氏菌容易轉(zhuǎn)變成慢性感染。近幾年發(fā)現(xiàn)，志賀氏菌不僅感染人，也可引起動物發(fā)病。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于志賀氏菌感染仔豬、幼犬、雞、鴨、犢牛等多種動物的報道，從而引起動物大批發(fā)病、死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。本病例中犢牛排血便、血尿，有可能是志賀氏菌感染了犢牛的腸道系統(tǒng)。但志賀氏菌為什么、如何侵襲直腸、結(jié)腸黏膜的機理暫時還不清楚。有研究認為是直腸、結(jié)腸黏膜在志賀氏菌存在的條件下對急性水腫異常敏感而導致；但也有研究認為是因為志賀氏菌表達的是一個結(jié)腸特定的黏附系統(tǒng)。有待進一步研究。

3.3 大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體耐藥性

藥敏試驗是研究藥物抑制、殺滅細菌的機理以及指導臨床用藥的依據(jù)之一。細菌接觸到抗生素以后，就處于生長和被抗生素抑制的競爭環(huán)境，故任何一個影響細菌生長分裂的因素都可以影響到抗生素對細菌的殺滅作用。抗生素可以啟動細菌的凋亡機制，而細菌則可以通過包括基因突變在內(nèi)的各種方式存活下來。

研究表明，從20世紀80年代到現(xiàn)在，志賀氏菌已對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性?？股氐拇罅?、廣泛使用是導致耐藥性產(chǎn)生的原因之一，細菌暴露在抗生素中的時間越長，其獲得耐藥性的幾率就越高。另有研究表明，志賀氏菌具有耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣等特點，對氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素等廣譜抗菌素的多重耐藥性逐年上升，對抗生素的耐藥率逐年提高，多重耐藥菌株的耐藥譜也在逐年增加。本試驗的研究表明，志賀氏菌對新霉素較敏感，臨床上可用其治療疾病。志賀氏菌對臨床上常使用的環(huán)丙沙星等抗生素敏感性很差，故可表明這些抗生素對細菌性痢疾已無多大療效，而青霉素、鏈霉素對菌痢的治療不起任何作用。

藥敏試驗還表明，傳統(tǒng)治療大腸桿菌的藥物（如慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢類藥物）對分離到的菌群均具有敏感性，如果及時使用，能很好地控制疫情。但大腸桿菌病對常用的抗生素的敏感性越來越弱，因而耐藥菌株日益增多。據(jù)文獻資料，從各地的各種動物中分離到的大腸桿菌對抗生素的敏感性差異很大，目前也較難確定一個能普遍適用的抗菌藥物敏感譜。臨床建議治療細菌性疾病的時候，最好選用經(jīng)抗生素敏感試驗確定為高度敏感的藥物進行治療，如此才能收到良好的治療效果。另外，本試驗表明支原體對環(huán)丙沙星、恩諾沙星敏感。另據(jù)文獻報道，在不同牛場分離到的牛支原體對藥物的敏感性有較大差異，故在臨床使用時，也應進行藥敏試驗來確定治療用藥物。早期使用泰樂菌素類（替米考星）及泰妙菌素類（支原凈）抗菌藥，對犢牛支原體病有一定療效。

3.4 臨床建議

綜合以上信息，該肉牛場的肉牛是混合感染了大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體而導致發(fā)病，根據(jù)以前報道的文獻資料及本次藥敏試驗結(jié)果，給牛場主以下臨床建議。

1）抗菌消炎。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，大腸桿菌、志賀氏菌對新霉素敏感，故可用新霉素制劑對發(fā)病牛群進行抗菌消炎。

2）對癥治療。對于發(fā)熱的?？捎媒鉄崴帲绨材私?、復方氨基比林；對于喘氣嚴重的牛應用支氣管擴張藥，如氨茶堿；同時由于肺炎導致肺水腫，可給以利尿脫水藥，如呋塞米，用量為0.5～1.0mg/kg體重，2次/d；對于體質(zhì)弱的牛補充能量、維生素C和復合維生素B。

3）牛舍和運動場要嚴格消毒。另一方面，由于肉牛在長途運輸過程中會受到不同程度的應激影響，運輸?shù)竭_目的地之后要重新適應新環(huán)境、飼料等，對生長非常不利。因此不建議從外地引進牛；如果可能，各牛場應按就近原則引進牛。如必須在外地引進，引進新牛群前，應對牛舍進行徹底地清洗、消毒，并對原有牛群進行免疫接種預防措施。新引進牛群在運輸過程中應該給予合理的飼養(yǎng)管理及飲水，忌太擁擠，引進后，注意日糧的合理搭配。

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