上皮細胞間質轉化對大腸癌肝轉移的早期預測和靶向治療的研究進展

程家樂(綜述)，汪 昱，姚 敬(審校)

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院普外科，上海200000)

隨著人民生活水平的提高，膳食結構發(fā)生明顯的變化，大腸癌成為目前國內高發(fā)的惡性腫瘤之一，大腸癌肝轉移尤其是影響生存率的最大因素。大腸癌肝轉移病因復雜，從正常大腸黏膜發(fā)展至大腸癌，大腸癌發(fā)展至肝轉移的過程是一個受多種因素影響的，多環(huán)節(jié)的復雜轉變過程，可能主要包含下列過程:正常上皮-癌前病變-大腸癌-正常間質-間質上皮化-上皮化間質癌變-癌灶轉移，整個過程伴隨著多種分子標志物的變化?，F(xiàn)就上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中出現(xiàn)的一些分子標志物，以及這些標志物對大腸癌肝轉移的早期預測和靶向治療的研究進展予以綜述。

1 上皮細胞間質轉化和致癌作用

最近，在一些腫瘤生物學的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多能標志腫瘤進展的分子機制，其中一項研究成果就是EMT的過程［1］。它是在胚胎形成的背景下首次發(fā)現(xiàn)的，在這個背景下，形態(tài)形成和器官形成包含了大量可塑性細胞，這些可塑性細胞在組織形態(tài)上可以從上皮細胞向間質細胞轉化，也可以從間質細胞向上皮細胞轉化。這樣的轉化也伴隨著分子學的變化，如鈣黏素、連環(huán)蛋白、蝸牛(Snail)家族蛋白，這些蛋白被稱作是EMT過程的調節(jié)因子［2］。大腸和肝臟的胚胎學解釋了EMT在胚胎形成中的作用。比如，眾所周知的一些遷移到大腸的細胞組成漿膜間皮，通過EMT的過程在大腸內部遷移，使大腸血管的血管平滑肌細胞數(shù)量增加。實驗證據(jù)表明，在肝臟發(fā)育的起始過程中表型和遺傳型參與 EMT［3］。

20年前的一些研究就表明這些形態(tài)學和間質細胞樣的改變也發(fā)生在培養(yǎng)液中的癌細胞，使得它們更具侵襲性，EMT同時也會阻礙細胞的凋亡，這是癌癥的特征性標志。比如，通過激活多種包括磷脂酰激酶3/蘇氨酸激酶和分裂素活化蛋白激酶在內的抗凋亡信號通路，EMT和Snail家族蛋白的轉錄控制能提高細胞的壽命［4］。研究顯示許多因素能夠誘導EMT，許多信號通路機制也參與其中。最近的一些動物實驗表明，EMT、致癌作用、癌癥轉移三者之間有著直接的聯(lián)系。一些人體的研究證實和原發(fā)腫瘤相比，在癌灶和轉移灶中有上皮分子標志物的缺失和間質分子標志物的獲得。然而，EMT與致癌作用及癌癥轉移的關系仍然存在爭議［5］。部分原因是絕大多數(shù)支持EMT加快致癌及癌癥轉移的數(shù)據(jù)來自細胞及動物模型，此外，一些研究甚至顯示腫瘤的進展和轉移可能與EMT無關。這個可能性在一個皮膚癌的動物實驗中被證實，這項研究的作者報道了在角質細胞中轉化生長因子 β1(transforming growth factor-beta-1，TGF-β1)的誘導而不需要功能性TGF-β1受體就能引起腫瘤的轉移，沒有 EMT的跡象［6］。

2 EMT對大腸癌肝轉移的影響

結腸癌是一個用來研究和了解腫瘤生物學非常好的模型。Vogelstein證明致癌作用的多步驟過程同樣適用于其他實體腫瘤。大腸癌目前證實是一個很好的模型，用來研究EMT在一般實體腫瘤中的角色。部分原因是它廣為人知地轉移至肝臟和其他的致命部位［7］。事實上，最近一項采用了轉錄分析技術分析報道的研究表明，326例結腸癌患者的微點陣數(shù)據(jù)與EMT信號的結腸癌基因表達模式有緊密聯(lián)系［8］。

可能已經(jīng)有證據(jù)證實EMT在結腸癌的影響，但是多年來并未認識到這一點。早在1998年就發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白細胞核(EMT的標志物)在大腸癌浸潤的邊緣過度表達［9］。很多問題沒有答案，包括結腸癌細胞能通過敵對的血流環(huán)境成功地轉移至肝臟。EMT可以提供一些解釋。以TGF-β1和Snail 1(蝸牛蛋白1)為例，著重討論EMT的生長誘導因子及轉錄調節(jié)因子在大腸癌中的作用。

TGF-β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在由高分化大腸癌細胞組成的三維細胞球體中能誘導EMT已經(jīng)被證實，在那個系統(tǒng)中，高分化的類器官結構被轉換成有很強遷移能力的單層結構。整合素αvβ6表達的增加伴隨著EMT。在異種移植的研究中，進一步說明在腫瘤細胞侵犯的周圍間質組織中，鈣黏素E的缺失與整合素αvβ6表達的增加有密切聯(lián)系。重要的是，對那些臨床患者組織的研究中，研究顯示這些數(shù)據(jù)標志著患者不良的預后。免疫組化研究顯示，F(xiàn)LH2(four-and-a-half LIM protein 2)在轉移的大腸癌組織中的高度表達，進一步證明了TGF-β1誘導的EMT在大腸癌的進展、侵襲及轉移的重要性。利用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究者發(fā)現(xiàn)FLH2在大腸癌細胞中直接誘導EMT，這是依靠上游通路TGF-β1的存在［10］。

一項獨立的研究也證明了Snail 1在大腸癌細胞中能誘導EMT，并用蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)了一系列新在Snail 1的控制下的蛋白質。此外，研究者利用免疫組織化學技術發(fā)現(xiàn)了一種Snail 1目標蛋白，14-3-3σ與臨床大腸癌患者密切相關［11］。Snail 1是EMT下游的轉錄調節(jié)器。Snail 1的上游調節(jié)是什么?隨后的研究顯示，TGF-β1在大腸癌中誘導EMT通過FLH2也證明Snail 1確實是那一通路的下游，作用是使鈣黏素E的轉錄表達上調［12］。因此，在大腸癌中，TGF-β1是Snail1控制的EMT的重要誘導因子。

此外，許多別的研究證明在不同的大腸癌細胞系中有EMT的誘導［13］。雖然大部分是體外實驗，這些研究已經(jīng)顯露出重要的潛在機制。因此，EMT似乎在大腸癌的發(fā)展及肝轉移中起著一定作用。更重要的是，在大腸癌EMT方面的研究可能會發(fā)現(xiàn)能有效地控制大腸癌肝轉移的重要的靶向治療。一項人體大腸癌細胞系和人體大腸癌組織的研究很好的證實了這個觀點，這個研究證實了環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)在轉移大腸癌中的過度表達和EMT分子特征有重要的相關性［14］。這個發(fā)現(xiàn)可能非常重要，因為許多先前的研究表明COX-2在大腸癌發(fā)展的過程中非常重要，并且COX-2抑制劑可能對大腸癌有輔助化療的效果。此外，普通大眾有應用COX-2抑制劑的經(jīng)歷，而且它的不良反應比其他化療藥物要小得多。

然而，仍有許多原因來質疑EMT在大腸癌發(fā)展、侵襲、肝轉移中的臨床重要性，一項最近的研究報道了神經(jīng)細胞黏附分子L1(β-連環(huán)蛋白的一個靶點)的強迫表達，促進了大腸癌的肝轉移而不通過誘導EMT［15］。特別是，在大腸癌組織的仔細研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤的邊緣與腫瘤中心相比，有鈣黏素E的異常表達。所以β-連環(huán)蛋白和鈣黏素E的核超表達都是EMT的標志，可能這些支持EMT出現(xiàn)在大腸癌的數(shù)據(jù)只出現(xiàn)在人體中，而并不出現(xiàn)在體外實驗中，這點原因還不是很明確，可能是因為他們所用的HCT116和SW620大腸癌細胞系處于微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)狀態(tài)和無功能的TGF-β受體Ⅱ狀態(tài)，這兩種狀態(tài)被證實與大腸癌中EMT的過程不能共同存在［16］。

另一個值得關注的理由是一些因子已知的復雜功能可能誘導EMT。TGF-β是一個典型的例子，這是研究得最好的誘導EMT的因子，最初它被認為是腫瘤的抑制因子，但是現(xiàn)在被證實腫瘤能夠抵抗它的抑制效果，所以它的功能變?yōu)橛H致癌性，誘導EMT，親轉移性。問題仍然是這些作用什么時候能在大量的癌癥中看見。實驗證明在早期大腸癌中TGF-β有抑制腫瘤的效果。目前的數(shù)據(jù)也表明TGF-β在大腸癌中的功能是誘導EMT，而不論是微衛(wèi)星穩(wěn)定或MSI狀態(tài)，也不論TGF-β受體功能的有無［16］。就這一點而言，一項研究顯示有EMT特征的大腸癌與微衛(wèi)星穩(wěn)定有重要的聯(lián)系［16］。MSI在EMT中的確切作用還不明確。確實，就像一項研究顯示的那樣，腫瘤細胞有MSI和有功能的TGF-β受體Ⅱ狀態(tài)在 TGF-β1的誘導下也經(jīng)歷 EMT［16］。因此，似乎是TGF-β1能否誘導EMT的關鍵在于是否存在TGF-β受體Ⅱ而不是MSI本身。

盡管EMT在大腸癌中的作用非常復雜，大量的數(shù)據(jù)表明EMT在大腸癌肝轉移中起著重要的作用。

3 針對EMT進行靶向治療的可能性和其預測大腸癌肝轉移的標志物

EMT作為一個生物學進程已經(jīng)提供了大量的腫瘤生物學信息。對它研究的價值實際上可能超出對腫瘤生物學本身的研究價值，因為在研究它如何調節(jié)腫瘤進展和轉移的過程中，發(fā)現(xiàn)一些分子標志物可能在腫瘤的進展和轉移方面起著決定性作用。更有研究顯示，這些標志物可以靶向逆轉EMT、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉移。人體研究也顯示許多標志物有重要的預測價值［17］。當然，大多數(shù)的標志物是在研究其他腫瘤時發(fā)現(xiàn)的，但是現(xiàn)將討論的范圍僅局限在大腸癌肝轉移的標志物中。

如上所述，大腸癌被證明是一個研究包括EMT在內的腫瘤生物學的好模型，對EMT在大腸癌的進展和轉移的研究中顯示了許多有前景的治療靶點和腫瘤進展的預測指標(圖1)。這些標志物包括brachyury 蛋白［18］、COX-2［14］、細胞外信號調節(jié)激酶［19］、連環(huán)蛋白 p120［20］、整合素 αvβ6［21］和 14-3-3σ［22］。αvβ6和 14-3-3σ 可能是大腸癌預后良好的分子標志物。但還需要大規(guī)模的人體研究來證實這個觀點。COX-2抑制劑是很有前途的，因為其廣泛應用于人群，并且事實上塞來昔布已經(jīng)被證實對家族性遺傳性腺瘤息肉病有效。然而，COX-2抑制劑對心腦血管的不良反應有待解決。細胞外信號調節(jié)激酶抑制劑在臨床前和第1階段的臨床試驗中也顯示出很大的前景。

圖1 EMT在大腸癌及大腸癌肝轉移中作用的原理圖

4 問題多于答案

研究者面臨的問題多于答案。是否人體大腸癌侵襲性和轉移性必須經(jīng)過EMT?微環(huán)境中究竟是什么本質的東西促使人體大腸癌的侵襲性和轉移性。關于腫瘤的微環(huán)境:腫瘤間質中的成纖維細胞和腫瘤內的低氧環(huán)境與EMT及致癌作用相關。研究發(fā)現(xiàn)，從人類乳腺癌組織中提取的成纖維細胞可以誘導EMT，并增加體外直接共同培養(yǎng)癌細胞模型的遷移能力［23］。低氧環(huán)境在大腸癌、乳腺癌、胰腺癌細胞系中能誘導EMT。然而，EMT可能從另一個重要的途徑影響腫瘤微環(huán)境的本質東西。一項研究顯示，癌細胞中的EMT誘導會導致多種包括白細胞介素8在內的趨化因子分泌的增加，同時白細胞介素8也會相應地增加EMT的誘導［24］。另外一些趨化因子CCL2和 CCL5與 EMT有關［25］。因此，EMT在腫瘤微環(huán)境中可以作為一個自立的過程，通過釋放趨化因子最終導致腫瘤的進展和轉移。

一些相關的問題始終存在。比如，腫瘤細胞是如何逃過肝臟的免疫敵對環(huán)境而移植到肝臟的?EMT是起到全部的作用還是部分作用?新興的數(shù)據(jù)似乎表明EMT是異質性的，許多癌細胞處于中間的不完全的EMT狀態(tài)［26］。同時，一些研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤的遠處轉移與EMT的逆轉移方向有關，這種現(xiàn)象稱作間質細胞上皮轉移。比如，在大腸癌中，發(fā)現(xiàn)肝轉移與miR-200C表達的增加和特征性EMT的增加密切相關［27］。MET在癌癥轉移中的確切作用存在爭議，因為在一些癌癥的數(shù)據(jù)中表明MET起到反腫瘤轉移的作用［28］。總之，哪些分子標志物可以作為腫瘤治療的靶點?這一問題仍然存在。

5 結語

很明顯，面臨的問題多于答案。體外實驗和動物實驗的數(shù)據(jù)表明腫瘤的進展和轉移與EMT有著密切聯(lián)系。但是，能支持這個觀點的人體研究相當有限。因此，需要更多的人體研究來明確EMT在人體腫瘤的進展和轉移方面的確切作用。同時，需要專業(yè)的研究來明確EMT過程中各靶點藥物在治療腫瘤的進展和轉移中的臨床效果。

［1］ Chaffer CL，Weinberg RA．A perspective on cancer cell metastasis［J］．Science，2011，331(6024):1559-1564．

［2］ Gumbiner BM．Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(8):622-634．

［3］ Su J，You P，Li WL，et al．The existence of multipotent stem cells with epithelial-mesenchymal transition features in the human liver bud［J］．Int J Biochem Cell Biol，2010，42(12):2047-2055．

［4］ Franco DL，Mainez J，Vega S，et al．Snail1 suppresses TGF-beta-induced apoptosis and is sufficient to trigger EMT in hepatocytes［J］．J Cell Sci，2010，123(20):3467-3477．

［5］ Turley EA，Veiseh M，Radisky DC，et al．Mechanisms of disease:epithelial-mesenchymal transition-does cellular plasticity fuel neoplastic progression?［J］．Nat Clin Pract Oncol，2008，5(5):280-290．

［6］ Han G，Lu SL，Li AG，et al．Distinct mechanisms of TGFbeta(1)-mediated epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis during skin carcinogenesis［J］．J Clin Invest，2005，115(7):1714-1723．

［7］ Wilmanns C，Steinhauer S，Grossmann J，et al．Site-dependent differences in clinical，pathohistological，and molecular parameters in metastatic colon cancer［J］．Int J Biol Sci，2009，5(5):458-465．

［8］ Loboda A，Nebozhyn MV，Watters JW，et al．EMT is the dominant program in human colon cancer［J］．BMC Med Genomics，2011，4:9．

［9］ Brabletz T，Jung A，Hermann K，et al．Nuclear overexpression of the oncoprotein beta-catenin in colorectal cancer is localized predominantly at the invasion front［J］．Pathol Res Pract，1998，194(10):701-704．

［10］ Zhang W，Jiang B，Guo Z，et al．Four-and-a-half LIM protein 2 promotes invasive potential and epithelial-mesenchymal transition in colon cancer［J］．Carcinogenesis，2010，31(7):1220-1229．

［11］ Larriba MJ，Casado-Vela J，Pendas-Franco N，et al．Novel Snail1 target proteins in human colon cancer identified by proteomic analysis［J］．PLoS One，2010，5(5)．

［12］ Zhang W，Wang J，Zou B，et al．Four and a half LIM protein 2(FHL2)negatively regulates the transcription of E-cadherin through interaction with Snail1［J］．Eur J Cancer，2011，47(1):121-130．

［13］ Bowen KA，Doan HQ，Zhou BHP，et al．PTEN loss induces epithelial-mesenchymal transition in human colon cancer cells［J］．Anticancer Res，2009，29(11):4439-4449．

［14］ Jang TJ，Jeon KH，Jung KH．Cyclooxygenase-2 expression is related to the epithelial-to-mesenchymal transition in human colon cancers［J］．Yonsei Med J，2009，50(6):818-824．

［15］ Gavert N，Vivanti A，Hazin J，et al．L1-mediated colon cancer cell metastasis does not require changes in emt and cancer stem cell markers［J］．Mol Cancer Res，2011，9(1):14-24．

［16］ Pino MS，Kikuchi H，Zeng M，et al．Epithelial to mesenchymal transition is impaired in colon cancer cells with microsatellite instability［J］．Gastroenterology，2010，138(4):1406-1417．

［17］ Chen LL，Chan THM，Yuan YF，et al．CHD1L promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis in mice and is associated with these processes in human patients［J］．J Clin Invest，2010，120(4):1178-1191．

［18］ Fernando RI，Litzinger M，Trono P，et al．The T-box transcription factor Brachyury promotes epithelial-mesenchymal transition in human tumor cells［J］．J Clin Invest，2010，120(2):533-544．

［19］ Tay PN，Tan P，Lan YH，et al．Palladin，an actin-associated protein，is required for adherens junction formation and intercellular adhesion in HCT116 colorectal cancer cells［J］．Int J Oncol，2010，37(4):909-926．

［20］ Bellovin DI，Bates RC，Muzikansky A，et al．Altered localization of p120 catenin during epithelial to mesenchymal transition of colon carcinoma is prognostic for aggressive disease［J］．Cancer Res，2005，65(23):10938-10945．

［21］ Bates RC，Bellovin DI，Brown C，et al．Transcriptional activation of integrin beta 6 during the epithelial-mesenchymal transition defines a novel prognostic indicator of aggressive colon carcinoma［J］．J Clin Invest，2005，115(2):339-347．

［22］ Larriba MJ，Casado-Vela J，Pendas-Franco N，et al．Novel Snail1 target proteins in human colon cancer identified by proteomic analysis［J］．PLoS One，2010，5(5)．

［23］ Gao MQ，Kim BG，Kang S，et al．Stromal fibroblasts from the interface zone of human breast carcinomas induce an epithelial-mesenchymal transition-like state in breast cancer cells in vitro［J］．J Cell Sci，2010，123(20):3507-3514．

［24］ Fernando RI，Castillo MD，Litzinger M，et al．IL-8 signaling plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition of human carcinoma cells［J］．Cancer Res，2011，71(15):5296-5306．

［25］ Soria G，Ofri-Shahak M，Haas I，et al．Inflammatory mediators in breast cancer:coordinated expression of TNF alpha＆IL-1 beta with CCL2＆CCL5 and effects on epithelial-to-mesenchymal transition［J］．BMC Cancer，2011，11(1):130．

［26］ Strauss R，Li ZY，Liu Y，et al．Analysis of epithelial and mesenchymal markers in ovarian cancer reveals phenotypic heterogeneity and plasticity［J］．PLoS One，2011，6(1):e16186

［27］ Hur K，Takahashi M，Balaguer F，et al．MicroRNA-200c/141 cluster as a control switch between epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)and mesenchymal-to-epithelial transition(MET)in human colorectal cancer metastasis［J］．Gastroenterology，2011，140(5):S817-S820．

［28］ Chen J，Wang L，Matyunina LV，et al．Overexpression of miR-429 induces mesenchymal-to-epithelial transition(MET)in metastatic ovarian cancer cells［J］．Gynecol Oncol，2011，121(1):200-205．