正十六烷降解菌的分離、鑒定及降解特性

張 楠，陳波水，方建華，王 九

(解放軍后勤工程學(xué)院，重慶 401311)

石油及石油產(chǎn)品主要由烷烴和芳香烴等碳?xì)浠衔锝M成，因其固有的生態(tài)毒性和難生物降解性而給環(huán)境帶來嚴(yán)重的危害[1，2]，石油烴污染環(huán)境的原位修復(fù)和異位修復(fù)一直是研究熱點(diǎn)[3～7]。生物修復(fù)通過添加營養(yǎng)物質(zhì)和(或)微生物提高污染物在環(huán)境中的生物降解能力[8，9]，是治理烴污染的有效方法。石油烴的生物降解過程和降解程度受溫度、pH值和微生物營養(yǎng)物質(zhì)(如某些含N、P的化合物)等因素的影響[10～14]。深入研究石油烴的生物降解過程和機(jī)制、了解烴降解菌的生理生化特性，是實(shí)現(xiàn)烴污染環(huán)境生物修復(fù)的重要基礎(chǔ)。

作者在此以正十六烷(以下簡稱C16)為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)從石油污染土壤中分離出1株C16降解菌，在對菌株進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，考察不同pH值條件下菌株對C16的降解能力，以期為石油烴污染的生物修復(fù)提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土壤樣本

重慶某油庫儲油罐附近土壤(砂土和沙壤土)。

1.2 主要培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.1 g，NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.01 g，CaCl20.05 g，用NaH2PO4-NaOH調(diào)節(jié)pH=5.0或用KH2PO4-K2HPO4調(diào)節(jié)pH=6.0、7.0、7.8，蒸餾水定容至100 mL，于121 ℃蒸汽滅菌30 min。

C16富集培養(yǎng)基：1.0 g C16加入100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。

C16無機(jī)鹽培養(yǎng)基：0.2 g C16加入100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。

1.3 C16降解菌的分離與鑒定

1.3.1 菌株的分離

采用富集法對C16降解菌進(jìn)行分離、純化。方法如下：土壤樣本經(jīng)破碎、過篩、除雜、混勻后，稱取50 g加入250 mL無菌水中，充分振蕩，浸泡并曝氣24 h；取適量接種于100 mL C16富集培養(yǎng)基中馴化，在37 ℃、160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，10 d為1個馴化周期，經(jīng)3個馴化周期后，取富集培養(yǎng)液在LB平板上分離、純化；據(jù)含甘油培養(yǎng)物保藏法于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將純菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，于32 ℃、200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)12 h，8500 r·min-1離心10 min，去上清，稱菌體濕重，用無機(jī)鹽培養(yǎng)基配成10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的菌懸液，備用。

1.3.2 菌株的鑒定

菌株的形態(tài)觀察方法參見文獻(xiàn)[15]。采用VITEK32型全自動微生物分析儀進(jìn)行自動化鑒定。

1.4 C16降解菌的降解特性測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取C16(分析純)0.0520 g、0.1011 g、0.1523 g、0.2024 g、0.2491 g，分別置于10 mL容量瓶中，用正己烷(分析純)定容并混勻。采用氣相色譜[GC900氣相色譜儀：FID檢測器；OV17毛細(xì)管氣相色譜柱；載氣(高純N2)流速50 mL·min-1；燃燒氣(H2)流速50 mL·min-1；空氣流速100 mL·min-1；檢測器溫度220 ℃；進(jìn)樣器溫度280 ℃；柱溫220 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL]測定C16的色譜峰面積，采用外標(biāo)法對峰面積(y)和C16質(zhì)量(x)進(jìn)行回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 降解特性研究

在pH值為7.0的100 mL C16無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入10%的菌懸液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)一定時間后，依次加入15 g NaCl、10 mL正己烷和100 μL 6 mol·L-1的HCl，于32 ℃、200 r·min-1搖床振蕩20 min，然后將培養(yǎng)液倒入分液漏斗靜置、分層，取上層清液置于25 mL消解管，加入1 g無水Na2SO4，搖勻，放入4 ℃冰箱中靜置1 d，采用氣相色譜測定C16峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算C16質(zhì)量，依下式計(jì)算C16降解率ε：

式中：m為C16降解后的質(zhì)量，g；m0為C16降解前的質(zhì)量，g。

1.4.3 pH值對菌株降解能力的影響

分別在pH值為5.0、6.0、7.0、7.8的100 mL C16無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入10%的菌懸液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5 d，采用氣相色譜測定峰面積，計(jì)算C16降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

從土壤樣本中分離出1株以C16為唯一碳源的菌株。該菌株在LB平板上的生長情況以及經(jīng)革蘭氏染色后的形態(tài)見圖1。

圖1 菌株的形態(tài)

由圖1可知，所分離的菌株在LB平板上的生長菌落為中等大小，不規(guī)則形，中間凸起，表面濕潤，透明，邊緣不整齊，平板呈淺綠色，革蘭氏染色陰性；在油鏡下呈卵圓形或短桿狀。

菌株全自動微生物分析鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株自動化鑒定結(jié)果

注：“-”表示反應(yīng)結(jié)果為陰性；“+”表示反應(yīng)結(jié)果為陽性

由圖1和表1初步確定菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

2.2 C16的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)

圖2 C16的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，擬合的C16回歸方程為：y=4942620x-5984,R2=0.9933。表明C16的質(zhì)量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 菌株對C16的降解作用

接種微生物的培養(yǎng)液中C16降解率隨降解時間的變化見圖3。

圖3 C16降解率隨降解時間的變化

由圖3可知，C16降解率隨降解時間的延長而升高，尤其是第3 d后降解率升幅更為明顯，到第6 d時降解率達(dá)97.3%。表明所分離的菌株具有良好的降解C16的能力，是有效的C16降解菌。

2.4 pH值對菌株降解能力的影響

不同pH值條件下，接種微生物的培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d后的C16降解率見圖4。

圖4 C16降解率隨pH值的變化

由圖4可知，在弱酸性至弱堿性(pH值6.0～7.8)條件下，C16能較好地被銅綠假單胞菌所降解；不同pH值下的降解率大小依次為pH值7.0>pH值6.0>pH值7.8>pH值5.0，即中性條件(pH值7.0)最適宜C16降解。在較強(qiáng)酸性條件(pH值5.0)下，菌株降解C16的能力較差，可能是酸性條件下菌株代謝途徑改變的緣故。

3 結(jié)論

經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離，獲得1株以C16為唯一碳源的菌株。根據(jù)形態(tài)觀察和自動化分析鑒定，初步確定該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。氣相色譜分析結(jié)果表明，所分離的銅綠假單胞菌菌株具有良好的降解C16的能力，且在中性條件下的降解能力最強(qiáng)。

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