2,2′-聯(lián)咪唑硝基衍生物的合成及與DNA相互作用的研究

楊莉?qū)?，?琳，余麗麗，楊黎燕，尤 靜

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 陜西 西安 710021)

咪唑是一種廣泛用于生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的化學(xué)藥劑，硝基咪唑類藥物除了具有顯著的抗菌活性外[1]，還具有抗病毒[2,3]、抗結(jié)核[4,5]、抗寄生蟲(chóng)[6～8]、抗腫瘤[9]等作用，目前已有眾多該類藥物應(yīng)用于臨床。鑒于硝基咪唑類藥物在抗微生物方面的突出效果，作者合成了2,2′-聯(lián)咪唑(H2biim)的單硝基衍生物NO2Hbiim和二硝基衍生物(NO2)2biim，對(duì)其進(jìn)行了表征，并采用紫外光譜法、熒光光譜法及粘度法初步研究了其與小牛胸腺DNA之間的相互作用方式，探討了化合物結(jié)構(gòu)與DNA相互作用之間的構(gòu)效關(guān)系。這些工作對(duì)于闡明小分子藥物對(duì)核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的影響、DNA靶標(biāo)藥物與DNA的相互作用機(jī)制具有一定的意義，為藥物的定向合成提供了理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

N,N-二甲基甲酰胺、冰醋酸、醋酐、醋酸銨、發(fā)煙硝酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris，阿拉丁試劑公司)，分析純；乙二醛水溶液，化學(xué)純；小牛胸腺DNA(ct-DNA)，生化試劑， Sigma公司。所有試劑用前未作進(jìn)一步處理；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Vario EL-ⅢG型元素分析儀，德國(guó)EA 元素分析系統(tǒng)公司；EQUINOX55 型紅外光譜儀，德國(guó) Bruker 公司；JA2003型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；STA449C型熱分析儀，德國(guó)Netzch公司；1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；Ubbeoldhe型粘度計(jì)，上海申玻玻璃儀器廠；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 2,2′-聯(lián)咪唑硝基衍生物的合成路線[10]及表征

2,2′-聯(lián)咪唑硝基衍生物的合成路線如下：

采用元素分析儀和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定化合物的元素分析值和紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)。

以KBr壓片，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定H2biim、NO2Hbiim、(NO2)2biim的紅外光譜。

采用熱分析儀進(jìn)行熱重分析，氮?dú)鈿夥?，流?0 cm3·min-1，升溫速率為20 ℃·min-1。

1.3 化合物與DNA相互作用實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所需試劑、緩沖溶液的配制以及與DNA相互作用研究均參照文獻(xiàn)[11,12]的經(jīng)典方法?？疾霥NA濃度對(duì)化合物紫外吸收光譜和熒光光譜的影響及化合物濃度對(duì)DNA粘度的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 2,2′-聯(lián)咪唑硝基衍生物的表征

2.1.1 元素分析和紫外吸收光譜分析(表1)

表1 化合物的元素分析及最大紫外吸收波長(zhǎng)

由表1可知，元素分析的實(shí)測(cè)值與理論值比較接近，基本可以確定4-硝基-2,2′-聯(lián)咪唑、4,4′-二硝基-2,2′-聯(lián)咪唑的組成。二者的最大紫外吸收峰分別位于271 nm和269 nm，歸因于其結(jié)構(gòu)中聯(lián)咪唑大環(huán)共軛體系的π-π*躍遷。與H2biim的紫外吸收峰相比，由于取代基硝基的作用導(dǎo)致NO2Hbiim和(NO2)2biim生色基的吸收峰向短波方向移動(dòng)，因而發(fā)生了紫移。

2.1.2 紅外光譜分析(表2)

表2 化合物的IR圖譜數(shù)據(jù)/cm-1

2.1.3 熱重分析(圖1)

圖1 NO2Hbiim和(NO2)2biim的熱重曲線

由圖1可知，兩種硝基衍生物熱分解趨勢(shì)類似，明顯分為兩步。二者的TG曲線分別在350 ℃和400 ℃之前幾乎是一平臺(tái)，對(duì)應(yīng)的DSC曲線顯示在這兩個(gè)溫度附近都有吸熱峰，歸結(jié)于兩種硝基化合物的熔化和分解吸熱，說(shuō)明NO2Hbiim和(NO2)2biim的熔點(diǎn)分別在350 ℃和400 ℃左右。隨后樣品開(kāi)始失重，TG曲線快速坍塌下滑，隨著化合物的分解，NO2Hbiim在接近380 ℃、(NO2)2biim在接近420 ℃時(shí)TG曲線下滑趨緩，失去了化合物中的不穩(wěn)定基團(tuán)后剩下的殘余物平緩分解直至完全。可以看出，(NO2)2biim比NO2Hbiim熔點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性更好。

2.2 2,2′-聯(lián)咪唑硝基衍生物與DNA相互作用的研究

2.2.1 與DNA相互作用的紫外吸收光譜分析

圖2為NO2Hbiim、(NO2)2biim與DNA相互作用的紫外吸收光譜。

由圖2可知，隨著DNA濃度的增大，NO2Hbiim的兩個(gè)最大紫外吸收峰出現(xiàn)減色效應(yīng)，且其中一個(gè)特征吸收峰明顯紅移，由原來(lái)的343 nm紅移到了353 nm；而(NO2)2biim則呈現(xiàn)增色效應(yīng)，吸收峰也發(fā)生很大程度的紅移，由原來(lái)的340 nm紅移到了380 nm。一般情況下，如果紫外吸收峰強(qiáng)度降低，波長(zhǎng)紅移，可認(rèn)為有小分子插入DNA分子中。因?yàn)镈NA堿基對(duì)與含螯合芳香環(huán)的小分子發(fā)生π電子堆積，堿基的π電子軌道與小分上的π*空軌道發(fā)生偶合，能級(jí)下降，π-π*躍遷能量減小，發(fā)生紅移現(xiàn)象；而且偶合后的π*軌道部分填充電子，π-π*躍遷幾率變小，也會(huì)發(fā)生減色效應(yīng)[13]。但某些化合物的吸收光譜因DNA的加入會(huì)出現(xiàn)增色效應(yīng)，這可能是因?yàn)檫@些化合物與DNA結(jié)合時(shí)，溶液中化合物分子之間氫鍵及化合物聚集體被破壞[14～16]。據(jù)此推測(cè)， NO2Hbiim是以經(jīng)典的插入方式與DNA作用，而(NO2)2biim可能是以非插入方式與DNA作用。

1～6，cDNA(×10-6mol·L-1)：0，0.6703，1.330，1.984，2.629，3.265

2.2.2 與DNA相互作用的熒光光譜分析

圖3為NO2Hbiim及(NO2)2biim與DNA相互作用的熒光光譜。

1～6，cDNA(×10-6mol·L-1)：0，0.6703，1.330，1.984，2.629，3.265

由圖3可知，NO2Hbiim、(NO2)2biim與DNA作用后其熒光強(qiáng)度隨著DNA濃度的增大逐漸增強(qiáng)且增幅較大，二者的最大熒光吸收峰的位置分別在515 nm、475 nm左右。它們與DNA之間可能發(fā)生了插入作用。因?yàn)榛衔镄》肿尤羟度隓NA雙螺旋堿基對(duì)之間，從溶液的親水環(huán)境進(jìn)入DNA內(nèi)腔的疏水環(huán)境，避免了溶劑分子的猝滅，即發(fā)生強(qiáng)烈的熒光敏化現(xiàn)象。根據(jù)增色程度大小判斷，NO2Hbiim與DNA的作用更強(qiáng)。NO2Hbiim分子和(NO2)2biim分子都含有聯(lián)咪唑環(huán)，但NO2Hbiim比(NO2)2biim分子少一個(gè)硝基，空間位阻更小，共平面性更好，因而插入DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間更容易，作用力更強(qiáng)。

2.2.3 與DNA相互作用的粘度分析

粘度法是在缺乏晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，確認(rèn)小分子化合物與DNA結(jié)合方式最有權(quán)威的證據(jù)之一[17]。當(dāng)小分子化合物插入DNA時(shí)，使DNA螺旋鏈增長(zhǎng)，DNA粘度相應(yīng)增大[18]；當(dāng)與DNA以非插入方式作用時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)伸展，DNA粘度基本不變。圖4為化合物濃度對(duì)DNA溶液相對(duì)比粘度的影響曲線。

由圖4可知，隨著NO2Hbiim濃度的增大，DNA的粘度呈增大趨勢(shì)；而(NO2)2biim濃度的增大對(duì)DNA的粘度基本沒(méi)有影響。由此判斷，NO2Hbiim以插入方式與DNA作用，(NO2)2biim以非插入方式與DNA作用，與光譜法研究結(jié)果一致。

圖4 NO2Hbiim和(NO2)2biim濃度對(duì)DNA溶液相對(duì)比粘度的影響

3 結(jié)論

合成了2,2′-聯(lián)咪唑的單硝基NO2Hbiim和二硝基衍生物(NO2)2biim。研究表明，NO2Hbiim是以經(jīng)典的插入方式與DNA相互作用，而(NO2)2biim是以非插入方式與DNA作用；化合物的結(jié)構(gòu)對(duì)其與DNA的相互作用有很大的影響；NO2Hbiim比(NO2)2biim的取代基少，位阻效應(yīng)弱，兩個(gè)咪唑環(huán)的共平面性更好，因而NO2Hbiim與DNA之間的作用強(qiáng)于(NO2)2biim。

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