NALP3炎癥復合體在口腔醫(yī)學領域的研究進展

包穆蓉 綜述;潘亞萍 審校

(遼寧 沈陽 110002:1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙體牙髓科;2.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙周科，)

先天免疫系統(tǒng)能快速識別并清除入侵機體的病原微生物，是機體免疫防御的第一道防線。在先天免疫應答中，免疫細胞對胞內感染的病原微生物及其產物的快速識別依賴于胞漿內存在的一類多蛋白復合體，稱為“炎癥復合體”［1］。在組裝炎癥復合體的多種蛋白質成分中，核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)樣受體(NOD like receptors，NLRs)家族成員，包括NALPs(NACHT，LRR and PYD domains-containing proteins)、白細胞介素轉化酶(interleukin-converting enzyme，ICE) 激 活 因 子 (ICE protease-activating factor，IPAF)等，通過識別胞內病原微生物及其產物，并感知來自宿主自身的危險信號而激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartatespecific protease，caspase)-1、caspase-5，調 控IL-1β、IL-18、IL-33等致炎細胞因子的合成、分泌和細胞凋亡，參與免疫應答和炎癥反應。自Martinon等［2］(2002)首次報道以來，迄今已鑒定出4種炎癥復合體，根據其核心成分NLRs不同，分別命名為NALP1、NALP2、NALP3和 IPAF炎癥復合體。目前口腔領域中主要集中于對NALP3炎癥復合體的研究。本文現就NALP3炎癥復合體的生物學功能及其在口腔領域的研究進展作一綜述。

1 NALP3炎癥復合體的結構和功能

人類NALP3炎癥復合體由NALP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)、caspase-1和CARDINAL(接頭蛋白)等4種蛋白質構成，主要參與IL-1β、IL-18等致炎因子介導的免疫炎癥反應。

1.1 NALP3的結構、功能和分布

在先天免疫系統(tǒng)中，免疫細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)直接識別廣泛存在于病原體上的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，同時可感知來自宿主自身的危險信號，即危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，引發(fā)受體配體反應，啟動有效的免疫應答。PRRs主要包括被稱為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)的膜結合受體和被稱為NLRs的胞漿內受體，兩者的區(qū)別是，TLRs負責胞外識別;NLRs主要負責識別胞漿內的 PAMPs及DAMPs。目前，人類NLRs家族約有23個成員，分為5個亞家族，包括 NALPs、NOD、IPAF、MHCⅡ類分子反式激活因子(classⅡ transactivator，CⅡTA)和神經元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP)。胞漿內受體 NALP3(又稱 NLRP3)作為NALP亞家族成員之一，起始NALP3炎癥復合體的組裝，是構成NALP3炎癥復合體的核心成分。

人類NALP3基因定位于1號染色體長臂4區(qū)4帶(1q44)，全長 3.1 kb，其基因編碼一個含有1036個氨基酸殘基、相對分子質量約為1.2×105的蛋白質。NALP3是一個具有復結構域的蛋白，包括3個特征性結構域:①羧基端的亮氨酸重復序列(leucine rich repeats，LRRs)，主要負責識別配體，包括病原體PAMPs和宿主DAMPs;②位于中央的NACHT(NAIP，CⅡTA，HET-E and TP1)，是NALP3的核心部分，對于NALP3的寡聚化和活化至關重要;③氨基端的PYD(pyrin domain)，通過同型募集PYD-PYD相互作用結合下游效應分子ASC，在NALP3的下游信號傳導中發(fā)揮關鍵作用(圖 1)［3］。

目前已知，NALP3表達于外周血的淋巴細胞、粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞;高表達于成骨細胞［4］以及復層上皮細胞，包括黏膜非角化鱗狀上皮細胞(口腔、食道、子宮頸和陰道部)和移行上皮細胞(膀胱和輸尿管)［5］。NALP3這種僅在復層上皮表達的局限性組織分布特征，提示其可能在機體抵御病原體侵襲的第一道防線中發(fā)揮關鍵作用。

1.2 ASC、caspase-1、CARDINAL 的結構和功能(圖 1［3］)

ASC，作為胞內一種重要的接頭蛋白，由氨基端的PYD和羧基端的caspase募集域(caspase recruitment domain，CARD)組成。ASC通過 PYDPYD相互作用與NALP3結合，并通過同型募集CARD-CARD相互作用與caspase-1前體結合，將病原體識別轉化為下游的信號傳導。

caspase-1包括一個CARD和一個催化區(qū)域，后者可將IL-1β前體轉化為IL-1β。如前所述，無活性的caspase-1前體與NALP3間接結合，引發(fā)自身催化反應，形成具有酶活性的caspase-1?；罨腸aspase-1將IL-1β前體轉化為IL-1β。實際上，IL-1β炎癥反應的限速步驟正是caspase-1的活化［6］。

CARDINAL，作為胞內另一種接頭蛋白，由FⅡND(function to find)和羧基端的CARD組成，參與NALP3炎癥復合體的寡聚化及caspase-1的活化。

圖1 NALP3炎癥復合體結構示意圖［3］

2 NALP3炎癥復合體的活化信號機制

眾所周知，IL-1β是炎性致病機制的決定因子，在免疫炎癥反應中發(fā)揮核心作用。以無活性形式合成的IL-1β前體必須經caspase-1剪切才能形成有活性的成熟IL-1β分泌到胞外，介導炎癥反應。caspase-1的活化是啟動IL-1β合成和分泌的關鍵步驟，而caspase-1的活化又受NALP3炎癥復合體的精密調控。因此，嚴密調節(jié)NALP3炎癥復合體的活化對調控IL-1β的合成和分泌意義重大。

當外界病原體 PAMPs和宿主 DAMPs被NALP3的LRRs識別并結合后，使處于自我抑制、無活性的NALP3發(fā)生結構變化，暴露出NACHT，形成活化的NALP3寡聚體;隨后，ASC依次通過PYD-PYD和CARD-CARD相互作用，“承上啟下”地將NALP3與pro-caspase-1間接結合，通過自身催化將caspase-1激活;活化的caspase-1將pro-IL-1β在116位天冬氨酸處裂解，形成成熟的IL-1β分泌到胞外，引起炎癥反應。NALP3炎癥復合體可識別多種病原體PAMPs和宿主DAMPs。近年研究證實:NALP3對細菌及其產物【如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖及其裂解產物胞壁酰二肽】、真菌菌絲、病毒等 PAMPs均有反應［7］。不同于其他炎癥復合體，NALP3的獨特之處在于對宿主DAMPs的識別，包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、尿酸鈉、細胞壓力(如形成活性氧序列)等［7］。

簡而言之，PAMPs和DAMPs被LRRs識別后，活化NALP3，結合 ASC，激活 caspase-1，加工分泌IL-1β，介導炎癥反應。

3 NALP3炎癥復合體與牙周病的關系

牙周病是牙周組織的慢性感染性疾病。如今，已清楚認識到牙周病的大多數組織損害是宿主對病原體感染的免疫應答。體內研究已證實IL-1是牙周炎病理發(fā)生的關鍵分子［8］。已知，IL-1β的成熟和分泌受caspase-1調控，而caspase-1的調控又與NALP3炎癥復合體密切相關，因此NALP3炎癥復合體對牙周病的發(fā)生發(fā)展和治療具有重要意義。

在牙周炎癥進程中，牙齦上皮細胞(gingival epithelial cell，GEC)是牙周宿主防御機制的第一道天然屏障。NALP3炎癥復合體功能性表達于GEC，誘導產生IL-1β，在牙周先天免疫應答中發(fā)揮重要作用［9］。作為目前公認的牙周致病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)感染GEC后誘導IL-1β基因的轉錄和IL-1β前體蛋白的胞內聚集，但IL-1β蛋白并未分泌到胞外;用ATP處理GEC后發(fā)現IL-1β被分泌到胞外，且不受Pg影響;進一步通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除 NALP3后發(fā)現 ATP誘導GEC分泌 IL-1β的能力有所減弱［9］。ATP從感染、瀕死、被壓細胞中釋放出來，與毗鄰細胞的“危險信號受體”相互作用，誘導宿主反應。已發(fā)現一種被稱為“P2X7”的胞外ATP受體在GEC細胞膜上功能性表達［10］。P2X7受體與胞外ATP結合后，不僅允許陽離子流動，還可從胞內排出IL-1β等代謝產物。研究表明［11］:胞外ATP刺激P2X7受體引起胞內鉀離子水平的突然降低是NALP3炎癥復合體激活的重要機制。因此，GEC的胞漿內受體NALP3通過識別胞外ATP(DAMP)，啟動 NALP3炎癥復合體，活化caspase-1，誘導IL-1β的成熟和分泌，進而介導牙周炎癥反應;但ATP與P2X7受體結合后誘導IL-1β分泌的確切機制有待進一步研究證實。此外，胞外ATP與P2X7受體結合后誘導GEC發(fā)生細胞凋亡［11］，NALP3炎癥復合體是否參與其中并發(fā)揮作用亦有待研究證實。

單核-巨噬細胞作為牙周宿主防御機制的重要組成部分，在動員宿主的抗菌防御中亦發(fā)揮重要作用。體外將Pg培養(yǎng)上清液與人單核細胞共培養(yǎng)后發(fā)現:NALP3、IL-1β、IL-18基因表達上調，ASC基因表達下降［12］。這與Taxman等用Pg活菌感染THP1單核細胞的研究結果相一致［13］。ASC是炎癥復合體的核心成分，當有ASC抗體或ASC非活化形式占優(yōu)勢時，caspase-1活化和IL-1β成熟即被阻斷［14］。因此推斷ASC表達下降可能抑制單核細胞中NALP3炎癥復合體的激活，進而抑制IL-1β的成熟和分泌;Pg可能通過此途徑潛在控制牙周宿主免疫反應，使自身有利于在感染的牙周組織中存活。

在先天免疫應答中，細胞因子的釋放先于細胞死亡。細胞因子釋放是早期免疫反應，而細胞死亡是大量細菌侵入后的晚期反應。高濃度Pg及其LPS可誘導人單核-巨噬細胞發(fā)生壞死樣細胞死亡;且這一過程與NALP3和ASC有關，與caspase-1和IL-1β無關［15］。由于caspase-1是啟動IL-1β活化的關鍵步驟，因此提示NALP3介導的炎癥復合體活化與細胞死亡機制可能不同。病原體Pg誘導單核-巨噬細胞的壞死樣細胞死亡可能成為一種新的免疫激活方式。在細胞壞死過程中，單核-巨噬細胞除釋放大量致炎因子外，其釋放的內容物亦向宿主免疫系統(tǒng)發(fā)出病原體入侵的級聯危險信號。值得一提的是:Huang等［15］首次觀察到在Pg誘導細胞死亡的同時伴有ASC聚合物的形成;進一步將轉染NALP3突變基因R260W的單核細胞用Pg感染后，發(fā)現ASC聚合物的形成顯著增加，提示Pg誘導ASC聚合物的形成是依賴于NALP3的。因此，NALP3和ASC在Pg誘導IL-1β釋放、ASC聚合物形成和細胞死亡中發(fā)揮關鍵性作用。ASC聚合物作為一個分子平臺，促進病原體誘導宿主細胞死亡。深入研究ASC聚合物，將有助于闡明病原體誘導牙周病的發(fā)病機制，并為牙周干預治療提供潛在靶點。

IL-1β除主要由激活的單核-巨噬細胞或淋巴細胞產生外，還可由成纖維細胞等釋放。體外將齦上、齦下菌斑培養(yǎng)上清液與人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblast，HGF)共培養(yǎng)后，發(fā)現［16］齦上菌斑誘導NALP3炎癥復合體及其終末效應分子IL-1β的基因轉錄增加，分析可能與牙周病的早期炎癥有關;而高濃度齦下菌斑刺激 HGF后NALP3、ASC、caspase-1和 IL-1β 基因表達均顯著下調，推測齦下菌斑可能通過抑制NALP3炎癥復合體信號通路，減少IL-1β等致炎因子生成，抑制牙周宿主免疫反應，從而有利于病原體在牙周組織中的存活。

此外，有研究發(fā)現:NALP3炎癥復合體突變可引起嚴重的自身炎癥性疾病，如類風濕性關節(jié)炎、克羅恩病、Muckle-Wells綜合征等，且NALP3的多點位點集中在高度保守的NACHT區(qū)［17］。目前，有關NALP3突變在牙周領域的研究工作尚未開展，但已觀察到IL-1β單核苷酸多態(tài)性與牙周病之間的相關性［18］。未來將深入研究 NALP3突變與IL-1β多態(tài)性之間的相互作用。NALP3突變有望成為識別牙周炎宿主易感性的遺傳標志。

4 NALP3炎癥復合體與白色念珠菌感染的關系

白色念珠菌(Candida albicans，Ca)作為一種常見的條件致病菌，是口腔念珠菌病的主要致病因素，IL-1β在宿主抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。研究證實［19-20］:NALP3能識別 Ca，啟動 NALP3炎癥復合體活化，誘導IL-1β加工分泌。靜脈注射Ca后，NALP3(-/-)鼠的肝、脾、腎中真菌量較對照組增加10～100倍［19］，提示NALP3缺陷可增強宿主對Ca的易感性。采用Ca持續(xù)感染口腔黏膜的鼠模型，發(fā)現NALP3炎癥復合體能阻止黏膜感染擴散，提高宿主鼠的生存率［20］。進一步研究證實:Ca從芽生孢子形式轉變?yōu)榧倬z形式，對于激活NALP3炎癥復合體是至關重要的;Ca突變體不能形成菌絲樣結構，因此無法激活NALP3炎癥復合體［19］。由此可見，NALP3炎癥復合體的活化取決于Ca形成假菌絲的能力。

因此，NALP3炎癥復合體可能在宿主抗真菌Ca的先天免疫防御中發(fā)揮積極作用。Ca假菌絲作為 NALP3的 PAMP，激活炎癥復合體，誘導IL-1β的加工分泌;并進一步強調了Ca在宿主免疫防御中表型可塑性的重要意義。

5 NALP3炎癥復合體與腫瘤的關系

研究已證實IL-1β與腫瘤的生長和轉移有關。黑色素瘤可分泌IL-1β，在其生長晚期，黑色素瘤細胞通過激活NALP3炎癥復合體自發(fā)分泌IL-1β，表現出自身炎癥性疾病的特征［21］。由于腫瘤源性IL-1β與腫瘤生長、免疫抑制和化學抵抗有關，因此NALP3炎癥復合體的活化預示疾病預后不良。另外，通過抑制caspase-1或使用針對ASC的siRNA，可減少黑色素瘤自發(fā)分泌 IL-1β［21］，提示抑制NALP3炎癥復合體信號通路有望成為治療黑色素瘤的方法。在先天免疫系統(tǒng)中，自然殺傷(natural killer，NK)細胞和巨噬細胞是重要的抗腫瘤效應細胞，能介導腫瘤的細胞毒性反應。新近研究證實:炎癥復合體的活化對機體獲得性免疫亦具有重要調控作用。將抗黑色素瘤細胞的樹突狀細胞疫苗接種于NALP3(-/-)鼠，結果發(fā)現免疫后鼠的生存率較對照組升高4倍［22］。疫苗效能的增強與樹突狀細胞無關，而與髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)有關。MDSCs可抑制機體的獲得性免疫和天然抗腫瘤免疫，促進腫瘤發(fā)展。研究證實［22］:MDSCs表達 NALP3，NALP3缺陷引起宿主鼠體內腫瘤相關MDSCs數量減少5倍。據此推斷，NALP3在促進腫瘤MDSCs聚集和抑制抗腫瘤T細胞免疫方面發(fā)揮重要作用。因此，NALP3炎癥復合體可能在抗腫瘤的先天免疫與獲得性免疫中發(fā)揮不同的調控作用。未來有望通過抑制NALP3信號通路來增強機體抗腫瘤的免疫反應。

6 結束語

綜上所述，NALP3炎癥復合體在口腔醫(yī)學領域的研究剛剛起步，雖已初步明確了NALP3炎癥復合體參與IL-1β等致炎因子介導的免疫炎癥反應，在牙周抗菌免疫、黏膜抗真菌免疫、抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，但依然存在大量研究空白，諸如NALP3對配體(PAMPs和DAMPs)的具體識別機制、NALP3炎癥復合體組裝和活化的調控因素、NALP3炎癥復合體與其他 PRRs(如 TLRs、NOD等)的相互作用及其在相關口腔疾病中的作用機制等。這些研究的深入開展將有助于闡明NALP3炎癥復合體相關口腔疾病的發(fā)病機制，并為拓展口腔疾病診治的新干預手段提供新的思路。

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