三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織表皮生長因子表達及血清、胃黏膜一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影響※

李光榮 屈樹行 張治秋 楊 劍 馬 麗 高 瑋

(河北省優(yōu)撫醫(yī)院內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

三參方對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織表皮生長因子表達及血清、胃黏膜一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影響※

李光榮 屈樹行1張治秋2楊 劍 馬 麗3高 瑋4

(河北省優(yōu)撫醫(yī)院內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的 研究三參方對慢性萎縮性胃炎(CAG)大鼠胃組織表皮生長因子(EGF)表達及血清、胃黏膜一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，以探討其治療CAG的作用機制。方法 將60只雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量分層隨機分為6組，即正常對照組、模型組、維酶素組、三九胃泰組及三參方高(3.67 g/mL)、低(1.83 g/mL)劑量組，每組各10只。正常對照組予蒸餾水灌胃，自由飲食、飲水;其余各組采用復合因素造模法復制大鼠CAG模型，連續(xù)8周。造模成功后，三參方高、低劑量及維酶素組、三九胃泰組分別予相應藥液10 mL/(kg·d)灌胃，正常對照組及模型組予等容積蒸餾水灌胃，連續(xù)35 d。觀察各組大鼠胃組織EGF表達及大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性、胃黏膜組織形態(tài)變化情況。結(jié)果 模型組大鼠胃黏膜上皮細胞可見不同程度的變性、壞死、脫落，腺體有不同程度的萎縮，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性粒細胞浸潤。各藥物組大鼠胃黏膜病變均有一定程度改善，其中三參方高劑量組大鼠胃黏膜腺體大小形態(tài)較一致，基本接近正常對照組。模型組大鼠胃黏膜EGF表達的OD值較正常對照組明顯增強(P＜0.01)，血清、胃黏膜NO含量和NOS活性明顯升高(P＜0.01)。維酶素組、三九胃泰組及三參方高、低劑量組OD值表達較模型組明顯減弱(P ＜0.05，P ＜0.01)，血清、胃黏膜 NO 含量和 NOS 活性降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，其中三參方高劑量組OD值表達與其他各治療組比較均明顯減弱(P＜0.01)，胃黏膜NO含量低于維酶素組(P＜0.05)，血清NO含量低于三九胃泰組(P＜0.05);三參方低劑量組及維酶素組OD值表達均較三九胃泰組弱(P＜0.05)，三參方高、低劑量組和三九胃泰組大鼠血清NO含量低于維酶素組(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)論 三參方可通過抑制胃組織EGF的過度表達，降低NOS活性，抑制血清、胃黏膜NO的過度釋放，促進胃黏膜細胞修復及再生，改善胃的功能狀態(tài)，以達到治療CAG的目的。

胃炎，萎縮性;慢性病;表皮生長因子;一氧化氮;一氧化氮合酶;疾病模型，動物;中藥療法

※項目來源:河北省中醫(yī)藥管理局2011年度中醫(yī)藥類科研計劃項目(編號:2011094)

1 河北省棗強縣人民醫(yī)院中醫(yī)科，河北 棗強 053100

2 河北省棗強縣人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 棗強 053100

3 河北省邯鄲市復興區(qū)疾病預防控制中心檢驗科，河北 邯鄲056003

4 河北省中醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050011

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)為消化系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，是由多因素引起的胃黏膜慢性炎性病理改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子(EGF)與胃黏膜疾病關系密切［1］。EGF是多肽生長因子之一，對胃黏膜具有保護作用，一旦過表達會使胃黏膜發(fā)生病變。此外，一氧化氮(NO)是一種對胃黏膜具有雙向調(diào)節(jié)作用的生物活性因子，一方面對胃黏膜具有保護作用，另一方面又可介導胃黏膜損傷性的炎癥反應［2］。三參方系經(jīng)多年臨床篩選治療CAG的經(jīng)驗方，在臨床上具有較好的臨床療效。為了探討其作用機制，我們通過實驗研究三參方對CAG模型大鼠胃組織EGF表達和胃黏膜組織形態(tài)變化的影響，以及對血清、胃黏膜NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，為臨床應用提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(冀)2008－1－003，動物合格證號1001005。將實驗大鼠放置于明、暗各12 h、溫度18～22℃的清潔級實驗室內(nèi)，適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要儀器 NO試劑盒、NOS試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;SP9001試劑盒及DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術有限公司;LAUDA－C3型循環(huán)恒溫水浴箱，泰克儀器有限公司;MSE－25型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;722可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;萊卡LEICA RM2245型石蠟切片機，萊卡上海分公司;Olympus BX－UCB型全能顯微鏡，日本Olympus公司;Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，廈門麥克奧迪光學儀器有限公司。

1.1.3 藥物及試劑 三參方藥物組成:黨參、玄參、丹參、白芍藥各15 g，白術、清半夏、陳皮各10 g，黃連、丁香、炙甘草各6 g。以上藥物均購自石家莊樂仁堂醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)鑒定符合國家2010年版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)定的相關標準。維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，國藥準字H13023904)，三九胃泰膠囊(三九醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字Z44020704)。EGF兔抗IgG多克隆抗體，博士德生物工程有限公司;增殖細胞核抗原(PCNA)鼠抗IgG單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 取雄性Wistar大鼠60只，按體質(zhì)量分層隨機分為6組，即正常對照組、模型組、維酶素組、三九胃泰組及三參方高、低劑量組，每組各10只。

1.2.2 CAG模型制備［3］除正常對照組外，其余各組大鼠先用0.2%脫氧膽酸鈉溶液1.5 mL/(只·d)灌胃，間隔5 h后，再用50℃熱水2 mL/(只·d)灌胃。與此同時，采用饑飽失常法喂養(yǎng)，即2 d足量喂食，1 d停食。正常對照組大鼠予等容積蒸餾水灌胃，自由飲食、飲水。持續(xù)8周。

1.2.3 藥液制備 三參方按中藥湯劑煎煮方法煎煮濃縮，配制成3.67 g/mL(高劑量)和 1.83 g/mL(低劑量)濃度的水溶液，三九胃泰和維酶素均用蒸餾水分別配制成1.0 g/mL濃度的混懸液。

1.2.4 給藥方法 造模結(jié)束后，三參方高、低劑量及維酶素組、三九胃泰組分別予相應藥液10 mL/(kg·d)灌胃。正常對照組及模型組予等容積蒸餾水灌胃。連續(xù)35 d。

1.2.5 標本采集及制備 第35 d給藥后禁食12 h(可自由飲水)后，將各組大鼠麻醉，取股動脈血，3 500 r/min，離心10 min，迅速分離血清，置4℃冰箱保存待檢。同時迅速打開腹部，將胃分離取出，沿胃竇近幽門口至胃大彎方向取適宜大小的組織塊，固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木—伊紅(HE)染色。另在胃竇部取適量胃組織，用0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸濕后，稱取濕質(zhì)量0.3 g左右，冰水中制成10%勻漿，3 500 r/min，離心10 min，提取上清液，置4℃冰箱保存待檢。

1.2.6 檢測項目及方法 胃黏膜形態(tài)觀察在光學顯微鏡下進行。免疫組化法觀察胃黏膜EGF的表達，經(jīng)DAB顯色后，細胞胞漿著色呈棕黃色或黃褐色顆粒者為陽性表達，陰性背景細胞核呈淺藍色或藍色。在200倍視野下每張切片選擇5個視野，分別經(jīng)顯微攝像系統(tǒng)輸入微機，利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，分別計算每個視野的陽性細胞平均光密度值(OD)值，取其平均值對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。血清和胃黏膜中NO含量和NOS活性測定均采用比色法，嚴格按照試劑盒說明書規(guī)定的方法檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜形態(tài)觀察結(jié)果 正常對照組大鼠胃黏膜上皮細胞呈單層柱狀，腺體排列整齊，腺上皮和腺管分界清楚，固有腺體及黏膜層毛細血管無擴張，未見炎癥反應。模型組大鼠胃黏膜上皮細胞可見不同程度的變性、壞死、脫落，黏膜下小血管清晰可見，腺體有不同程度的萎縮，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性粒細胞浸潤。各藥物組大鼠胃黏膜病變均有一定程度改善，其中維酶素組、三九胃泰組與模型組比較，胃黏膜腺體排列較為整齊，有少量炎性細胞浸潤;三九胃泰組胃黏膜部分上皮細胞可見變性、脫落。三參湯高、低劑量組大鼠胃黏膜腺體排列較整齊，未見炎性細胞浸潤，尤其是高劑量組大鼠胃黏膜腺體大小形態(tài)較一致，基本接近正常對照組。

2.2 各組大鼠胃組織EGF表達情況比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，EGF表達于胃壁細胞胞漿內(nèi)，鏡下呈棕黃色或黃褐色顆粒。正常對照組大鼠胃壁細胞胞漿內(nèi)可見散在淺黃色顆粒表達。模型組胃壁細胞胞漿內(nèi)表達明顯增加，可見棕黃色顆粒密布，且部分融合成片。各藥物組大鼠胃壁細胞胞漿內(nèi)EGF的表達均有明顯降低，其中三參方高劑量組EGF的表達較三參方低劑量組、維酶素組及三九胃泰組減弱。

2.3 各組大鼠胃組織EGF表達的OD值比較 見表1。

表1 各組大鼠胃組織EGF表達的OD值比較±s

表1 各組大鼠胃組織EGF表達的OD值比較±s

與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與維酶素組比較，△P ＜0.01;與三九胃泰組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與三參方低劑量比較，○P＜0.01

組 別 n OD值正常對照組 10 0.182 ±0.042＊＊模型組 10 0.364 ±0.036維酶素組 10 0.274 ±0.042＊＊#三九胃泰組 10 0.311 ±0.028*三參方高劑量組 10 0.207 ±0.041＊＊△##○三參方低劑量組 10 0.266 ±0.049＊＊#

由表1可見，模型組大鼠胃黏膜EGF表達的OD值較正常組明顯增強(P＜0.01)。維酶素組、三九胃泰組及三參方高、低劑量組OD值表達均較模型組減弱(P＜0.05，P＜0.01)，其中三參方高劑量組OD值表達與其他各治療組比較均明顯減弱(P＜0.01)，三參方低劑量組及維酶素組OD值表達均較三九胃泰組減弱(P＜0.05)。

2.4 各組大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比較見表2。

表2 各組大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比較±s

表2 各組大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比較±s

與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與維酶素組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與三九胃泰組比較，#P ＜0.05

組 別 n NO血清(μmol/L) 胃黏膜(μmol/g prot)NOS血清(U/mL) 胃黏膜(U/mg prot)正常對照組 10 73.25±9.76＊＊ 5.71±0.84＊＊ 18.32±1.95＊＊ 2.33±0.31＊＊模型組 10 125.72 ±14.31 8.01 ±1.02 29.21 ±3.02 3.66 ±0.46維酶素組 10 98.85±9.63* 7.19±1.05* 21.28±2.16＊＊ 2.62±0.42*三九胃泰組 10 88.54±9.16＊＊△ 6.46±0.93* 20.63±2.26＊＊ 2.51±0.43*三參方高劑量組 10 78.65±8.25＊＊△△# 6.18±0.92＊＊△ 19.36±2.14＊＊ 2.41±0.38＊＊三參方低劑量組 10 84.38±10.57＊＊△ 6.89±0.86* 20.64±2.36＊＊ 2.59±0.51*

由表2可見，與正常對照組比較，模型組大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性明顯升高(P＜0.01)。維酶素組、三九胃泰組及三參方高、低劑量組大鼠血清、胃黏膜NO含量和 NOS活性均較模型組降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中三參方高、低劑量組和三九胃泰組大鼠血清NO含量低于維酶素組(P＜0.01，P＜0.05);三參方高劑量組胃黏膜NO含量低于維酶素組(P＜0.05)，血清NO含量低于三九胃泰組(P＜0.05)。

3 討論

CAG屬于中醫(yī)學痞滿、胃脘痛、胃脹等范疇，其發(fā)病多責之于飲食不節(jié)或恣食生冷肥甘厚味之品;或七情不暢，郁怒傷肝，肝氣橫逆犯胃致肝脾不和或肝胃不和;或勞倦過度，勞則氣耗，脾胃之氣大傷，無力運化水谷精微;或先天稟賦不足，無以充養(yǎng)后天，脾胃虛弱等。其病位主要在胃，病機為氣陰不足，胃腑失養(yǎng)，氣機失和。而脾與胃互為表里，同居中焦，肝主疏泄，主中焦氣機之升降，所謂“土得木則達”，故本證治療宜脾胃同治，肝胃同調(diào)。三參方方中黨參配白術益氣健脾養(yǎng)胃;玄參配白芍藥、炙甘草滋陰益胃柔肝;丹參配陳皮調(diào)暢胃中氣血;黃連配清半夏、丁香通降胃氣。全方總以益氣養(yǎng)陰、扶助中州為主，并佐柔肝之法。然六腑以通為用，胃氣以降為順，故于補益之中又寓通降之法，既可通降胃氣，又防補益壅遏之弊，此即葉天士“治胃則宜涼潤通降”之旨。諸藥合用則氣陰雙補，脾胃健運，氣機條暢，從而達到治療CAG的目的。

EGF是一種能夠促進多種細胞增殖分化的低分子多肽，主要由頜下腺、胃、胰腺、十二指腸黏膜的類似十二指腸腺(brun－ner腺)等分泌。該因子廣泛存在于消化道內(nèi)，可以調(diào)節(jié)消化道黏膜的生長、分化及成熟，抑制胃酸分泌，具有促進上皮細胞增殖、細胞保護和組織修復的作用，在保護胃黏膜免受損傷因子的破壞、維持胃腸黏膜的完整性方面起著重要作用［4］。EGF也是調(diào)節(jié)胃腸道動力的重要生理因子，能夠影響許多器官平滑肌的收縮活動，延緩小腸動力及胃排空。此外，EGF還可以提高機體對葡萄糖和氨基酸的吸收，促進多種細胞生長，并能促進上皮細胞內(nèi)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及蛋白質(zhì)的合成，營養(yǎng)細胞。由此可見，EGF的正常表達在CAG病變及修復過程中具有較為重要的作用，一旦表達過度，可引起胃黏膜細胞受損，細胞炎性反應加重、過度增殖，病變逐步進展，進而導致CAG。本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠EGF的表達明顯增強，表明EGF營養(yǎng)和保護胃黏膜的功能減弱，胃黏膜病變逐漸加重。經(jīng)治療后，三參方高、低劑量組與模型組比較，EGF表達均明顯減弱，說明三參方可通過抑制胃組織EGF的過度表達，促進胃黏膜細胞修復及再生，改善胃的功能狀態(tài)，這可能是三參方治療CAG的作用機制之一。

NO是人體內(nèi)的一種具有生物活性的信息分子，是生物體內(nèi)重要的生理信使和病理介質(zhì)，它不僅參與機體多種細胞的不同生理作用，而且還參與多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程［5］。機體內(nèi)的NO主要以L－2精氨酸為底物，并由NOS催化，在一些相關因子如黃素單核苷酸、還原型輔酶及四氫生物蝶呤等輔助下生成。NOS是NO合成過程中惟一的酶，根據(jù)NOS的編碼基因和生物學特性，可將NOS分為內(nèi)皮型(eNOS)、誘導型(iNOS)及神經(jīng)型(nNOS)。巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等處為iNOS主要分布場所。一般iNOS基因在正常情況下并不表達，但在體內(nèi)某些因素如細胞因子和內(nèi)毒素的刺激作用下，才進行轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生iNOS，進而活化產(chǎn)生大量NO。胃黏膜中NOS分布廣泛，說明NO參與了胃的各種生理功能。NO在適度表達的情況下對胃黏膜產(chǎn)生保護作用，但NO釋放過量可導致自身正常組織損傷，介導胃黏膜產(chǎn)生不同程度的損傷性炎癥反應，表現(xiàn)為細胞毒作用［2］。本研究顯示，模型組大鼠血清、胃黏膜NO含量增加，NOS活性增強，說明NO、NOS在CAG發(fā)生、發(fā)展過程中起著比較重要的作用，NOS活性增強、NO合成及釋放過多介導了GAS的發(fā)病過程。因此，NO含量和NOS活性的變化可以作為CAG臨床診斷和病情輕重的參考指標之一。經(jīng)治療后，三參方高、低劑量均可降低大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性，保護胃黏膜，促進胃黏膜修復，改善胃功能，此可能是三參方治療CAG的又一作用機制。

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Effect of Sanshenfang on epidermal growth factor expression of the gastric tissue and content of carbon monoxide and nitric oxide synthase activity in serum and gastric mucosa of rat model with chronic atrophic gas-tritis

LI Guangrong*，QU Shuxing，ZHANG Zhiqiu，et al.*Medical Department，Privilege Hospital of Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050051

ObjectiveTo explore the effect of Sanshenfang on epidermal growth factor expression of the gastric tissue and content of carbon monoxide and nitric oxide synthase(NOS)activity in serum and gastric mucosa of rat model with chronic atrophic gastritis.Methods60 male Wistar rats，stratified by body mass were randomly divided into six groups，the normal control group，model group，Vitacoenzyme group，Sanjiuweitai group and Sanshenfang high－(3.67 g/mL)，low － dose(1.83 g/mL)group.Rats in normal control group were given distilled water，free food，drinking water.Remaining groups were copy the model of rat CAG by composite factors modeling method for 8 weeks.Sanshenfang high－，low－dose，Vitacoenzyme and Sanjiuweitai were given in different groups after the modeling for 35 days.EGF expression of the rat’s gastric tissue，NO content and NOS activity in serum and mucosa and gastric mucosa morphological changes were observed.ResultsRat gastric mucosal lesions have a certain degree improvement in each drug group，which size and shape of rat gastric mucosa glands in Sanshenfang high－dose group is more consistent with the normal control group.OD values of rat gastric mucosa VEGF expression in the model group were significantly enhanced in comparison with normal group(P ＜0.01).NO content and NOS activity in serum and mucosa was significantly higher(P ＜0.01).OD values of rat gastric mucosa VEGF expression in，Sanjiuweitai group and Vitacoenzyme group were significantly weakened as compared with that in model group(P ＜0.05，P ＜0.01)，NO content and NOS activity in serum and mucosa was decreased as compared with that in model group(P ＜0.05，P ＜0.01).OD value of the expression in Sanshenfang high － dose group were significantly weakened as compared with that in the other treatment group(P ＜0.01)，NO content in mucosa was lower than that in Vitacoenzyme group(P ＜0.05)，NO content in serum in was lower than that in Sanjiuweitai group(P ＜0.05).NO content in serum Sanshenfang high－ ，low －dose group and Sanjiuweitai group was lower than that in Vitacoenzyme group(P ＜0.01，P ＜0.05).ConclusionSanshenfang can suppress overexpression of EGF in gastric tissue，reduce NOS activity，inhibit the excessive release of NO in serum and mucosal，promote the repair and regeneration of gastric mucosal cells，and improve the functional state of the stomach and achieve therapeutic CAG.

Chronic atrophic gastritis;Epidermal growth factor;Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Animal;Experiments;Chinese medicine therapy

R573.32;R285.5;R9－331

A

1002－2619(2012)12－1862－04

李光榮(1964—)，男，副主任中醫(yī)師，學士。從事中醫(yī)內(nèi)科臨床工作。研究方向:消化系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥治療。

2012－06－09)