的士寧與MK801共同作用改善大鼠腦缺血再灌注后學習記憶能力缺陷

朱 瑩 涂靜宜 張 熙 周彩鳳 劉 斌 王瑞敏*

(河北聯(lián)合大學醫(yī)學實驗研究中心，①附屬醫(yī)院 河北唐山 063000)

腦血管疾病是嚴重危害人類健康的三大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點，是中老年人致死和致殘的主要疾病。缺血使細胞供氧減少引起突觸間隙谷氨酸濃度顯著增加，導致對突觸后受體的過度刺激，特別是NMDA受體亞型。造成突觸后神經元的大量Ca2+內流，通過激活各種胞內酶而使細胞死亡［1］。缺血缺氧后神經元釋放大量興奮性氨基酸，通過激活興奮性氨基酸NMDA受體而引起神經元內的鈣離子超載，是神經元缺血缺氧性損傷的重要機制［2］。MK801是NMDA受體的非競爭性阻斷劑，整體動物實驗研究顯示，MK801可以有效減輕腦的缺血性損傷，但也有相反報道［3，4］，本實驗室研究表明缺血后單獨給予MK801對神經元損傷無明顯保護作用。

NMDA受體甘氨酸位點拮抗劑能有效保護局部缺血的大腦組織［5］，它在抑制腦部某些區(qū)域高水平谷氨酸影響的同時，又能相對保持腦部其他區(qū)域正常神經遞質的傳遞，且沒有其他NMDA受體拮抗劑普遍存在的細胞空泡化的現(xiàn)象［6］。士的寧(strychnine)能特異性阻斷甘氨酸與其受體的結合。本研究采用缺血后尾靜脈注射甘氨酸及其拮抗劑的士寧，研究其形態(tài)學及學習記憶能力的改變旨在探討其在海馬神經元缺血損害中的作用，為缺血性腦損害探索新的治療途徑。

1 材料與方法

1．1 材料 SPF級成年雄性SD大鼠購于北京實驗動物中心，體質量250～300g，于22～26℃環(huán)境下自由喂養(yǎng)。NBT/BCIP購自Amresco公司。其他試劑均為國產分析純。Morris水迷宮設備為淮北正華儀器設備有限公司生產。

1．2 大鼠腦缺血再灌注模型的建立及實驗分組 制作大鼠4動脈結扎全腦缺血模型［7］:實驗第1天，大鼠腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)，麻醉后，電凝雙側椎動脈使之永久閉塞，并分離雙側頸總動脈。24h后在大鼠清醒狀態(tài)下用動脈夾夾閉雙側頸總動脈造成全腦缺血，持續(xù)10min，松開動脈夾使腦血流再通。缺血時保持其直腸溫度在36．5～37．5℃。成功的腦缺血模型表現(xiàn)為:大鼠于4動脈閉塞后30～60s內昏迷，翻正反射、角膜反射消失，雙側瞳孔散大，能自主呼吸，腦電圖呈直線。實驗動物隨機分為 Sham組、I/R組:缺血10min再灌注12d)、缺血及MK801組、甘氨酸及其抑制劑組。Sham組不結扎雙側頸總動脈，其余處理同I/R組。每組動物15只。

1．3 尾靜脈注射 MK801組缺血10min后即刻注射MK801，劑量:1．0mg/kg。的士寧與MK801的共同作用組缺血10min后即刻尾靜脈注射Glycine+Strychnine+MK801，劑量:1．0mg/kg，Glycine:400mg/kg，Strychine:0．5mg/kg。

1．4 Morris水迷宮 參照 Yan等方法［8］，實驗第1天(即缺血后第7天)，大鼠分別從各個象限面壁入水，記錄到達平臺時間(時間限90 s)，如果大鼠在90 s內不能找到平臺，引導其找到平臺，在站臺上休息 20s，此為訓練實驗。間隔 4h、1、2、3、4d(即缺血再灌注第7、8、9、10、11天)分別重復以上實驗，此為正式實驗，系統(tǒng)自動記錄大鼠入水后找到平臺的游泳時間即潛伏時間(latency time)和游泳的路程;實驗目的在于檢測大鼠的學習能力。缺血再灌注第11天，完成潛伏實驗后4h進行空間探索實驗，即撤掉站臺，將大鼠分別從不同象限入水，測量其90s內在原有平臺象限停留的時間即探索時間和游泳路程。此實驗用于衡量大鼠的空間記憶能力。

1．5 樣本取材及焦油紫染色 大鼠缺血10min再灌注12d后，用20% 水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后于劍突下橫向沿胸壁左右向剪開暴露心臟，用平頭穿刺針從心尖插入左心室，剪開右心耳，生理鹽水灌洗至肝臟變白，4%多聚甲醛約300mL先快后慢灌注至四肢僵硬，斷頭取腦，后固定6小時，30%的蔗糖脫水至腦組織沉底，OCT包埋。海馬行冰凍連續(xù)冠狀切片，厚度25μm。

焦油紫染色方法:按本室方法［9］制備大鼠腦石蠟切片，進行焦油紫染色，光鏡下觀察海馬CAl區(qū)錐體細胞的損傷情況。神經元細胞核清晰可見，胞體著色良好的計為成活神經元，CA1區(qū)每1mm長存活神經元數(shù)目代表神經元生存密度。

2 結果

2．1 的士寧與MK801共同作用對海馬CA1區(qū)錐體神經元的損傷具有保護作用 如圖1所示:Sham組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊，形態(tài)完整，核膜邊界清楚，核仁清晰，深染。I/R(缺血10min再灌注12d)，海馬CA1區(qū)錐體細胞顯著損傷，細胞排列紊亂，大部分細胞胞核固縮，碎裂，核膜界限不清。MK801組(缺血10min后即刻尾靜脈注射MK801再灌注12d)海馬CA1區(qū)存活的神經元較I/R組無顯著增加。而的士寧與MK801的共同作用(缺血10min后即刻尾靜脈注射Gly+Stry+MK801再灌注12d)海馬CA1區(qū)存活的神經元較I/R組有更顯著增加，與sham組無顯著差別。

圖1 的士寧(strychnine)與MK801共同作用對缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經元生存的影響

2．2 的士寧與MK801共同作用有效改善大鼠腦缺血再灌注后空間學習記憶功能 Morris水迷宮實驗顯示大鼠的潛伏時間及其活動軌跡(圖2A，C:a～d)，腦缺血后第 7、8、9、10、11 天每組大鼠的潛伏時間逐漸縮短;再灌注同天，I/R組潛伏時間與Sham組相比明顯延長，的士寧與MK801共同作用組較Vehicle組明顯縮短。圖2B，C:e～h為大鼠的探索時間和活動軌跡。結果顯示Sham組活動軌跡集中于站臺附近;I/R組與Vehicle組活動軌跡較分散;MK801組活動軌跡較分散，的士寧與MK801共同作用組活動軌跡集中于站臺附近，大致同Sham組。

圖2 Morris水迷宮實驗觀察的士寧(strychnine)與MK801共同作用對大鼠缺血后學習記憶能力的影響

3 討論

腦復蘇中存在全腦缺血再灌注損傷，而對腦缺血再灌注損傷的研究仍然是急診醫(yī)學中的重點，腦缺血再灌注模型的制作則是研究工作的重要環(huán)節(jié)［10］。在建立全腦缺血再灌注模型的方法中，四血管阻塞法建立大鼠全腦缺血再灌注動物模型是應用較為廣泛的一種建模方法，該方法具有操作相對簡便，可較好地模擬臨床上因低血壓休克、心肺腦復蘇等造成的全腦缺血性損傷過程，易于做大宗實驗等優(yōu)點，至今仍廣泛應用于研究中［11］。

海馬結構作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學習記憶、情緒反應及植物神經功能等方面發(fā)揮著重要作用。有證據(jù)表明，海馬對于空間信息的獲得、檢索、鞏固和存儲是必需的［12］。海馬CA1區(qū)神經元對缺血具有選擇性敏感，腦缺血再灌注可導致腦易感區(qū)選擇性遲發(fā)性神經元損害，以海馬CA1區(qū)最為敏感［13，14］很多學者都以海馬CA1區(qū)神經元損傷作為模型，試圖研究腦缺血的病理生理機制［15，16］。慢性腦低灌注大鼠海馬神經元變性、壞死和脫失，導致空間學習記憶能力的顯著下降［17］，應用Morris水迷宮檢測定位航行潛伏期和空間探索次數(shù)，結果顯示缺血再灌注大鼠在造模后11日出現(xiàn)定位航行潛伏期延長和空間探索次數(shù)減少，與本實驗中海馬CA1區(qū)神經元的減少一致，表明海馬神經元的減少與缺血再灌注大鼠的認知功能障礙有關。

NMDA受體激活后可造成大量Ca2+內流，引起Ca2+超載并促發(fā)自由基連鎖反應，使得神經元死亡，導致缺氧缺血性腦損傷，故如何阻止細胞外鈣離子流入細胞內，是研究缺氧缺血性腦病治療中的重要課題。缺血前給予MK 801能占領離子通道結合點，阻止NMDA受體的反應，減輕細胞外鈣離子進入細胞內所引起的神經細胞損傷［18］，達到預防和治療缺氧缺血性腦損傷的目的。而本研究表明在缺血后給予MK801沒有明顯的保護作用，其原因可能與缺血時由于能量耗竭，使細胞膜表面鈉鉀－ATP酶活性降低，導致離子交換障礙，使膜離子梯度難以維持，細胞膜去極化，使鈣通道開放，細胞內增多的鈣離子，已經引起鈣離子超載。而這時候給予MK801即沒有明顯的保護作用。

甘氨酸屬于抑制性神經遞質，激動甘氨酸受體可使神經元膜超極化，降低神經元的興奮性。如腦缺血時使用可望抑制谷氨酸等興奮性氨基酸對神經元的興奮性毒性，起到神經保護作用。甘氨酸雖然激動甘氨酸受體能力最強，但在腦內它同時還是谷氨酸受體中NMDA亞型受體的輔助激動劑，不當使用反會加強谷氨酸對神經元的興奮性毒性，加重缺血缺氧性腦損傷［19］。本研究結果顯示，加入外源甘氨酸后，腦損傷加重，且學習記憶能力也較缺血再灌注大鼠有一定程度的下降。

許多研究證實非競爭性［20］和競爭性［21］NMDA受體拮抗劑對大腦缺血有保護作用。許多研究認為，甘氨酸位點拮抗劑最有希望成為新型的治療和預防神經退行性疾病的藥物［22］。但是早期的NMDA受體拮抗劑因其全身使用的不良反應(學習能力受損［23］、精神癥狀［24］和神經毒性［25］)而導致臨床應用受限。NMDA受體甘氨酸位點拮抗劑的士寧能有效保護局部缺血的大腦組織［5］，它在抑制腦部某些區(qū)域高水平谷氨酸影響的同時，又能相對保持腦部其他區(qū)域正常神經遞質的傳遞，且沒有其他NMDA受體拮抗劑普遍存在的細胞空泡化的現(xiàn)象。我們的研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后CA1區(qū)神經元明顯少于正常對照組。治療組中，給于的士與MK801共同作用組CA1區(qū)神經元顯著高于缺血再灌注組。且學習記憶功能高于缺血再灌注組，其原理尚不明確，需進一步研究。

［1］ 黃世杰．新的強神經保護劑甘氨酸拮抗劑GV150526的發(fā)現(xiàn)和藥理特征［J］．國外醫(yī)學藥學分冊，1999，26(1):23

［2］ Lipton．Ischemic cell death in brain neurons［J］．Physiol Rev，1999，79(4):1431

［3］ Foster AC，Gill R，Kemp JA，et al．Protection of N － methyl－ D － aspartate induced neuronal degeneration by systemic administration of MK801［J］．Br J Pharmacol，1986，89:870

［4］ Yam PS，Dunn LT，Graham DI，et al．NMDA receptor blockade fails to alter injury in focal cerebral ischemia［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(5):772

［5］ Gill R，Hargreaves RJ，Kemp JA．The neuroprotective effect of the glycine site antagonist 3R－(+)－cis－4－methyl－ HA966(L－687414)in a rat model of focal ischaemia［J］．Cereb Blood Flow Metab，1995，15:197

［6］ 邱偉強，張純，王薇，等．NMDA受體甘氨酸位點拮抗劑Y1231對視網膜缺血再灌注損傷后 RGCs的影響［J］．眼科研究，2008，26(6):401

［7］ Wang RM，Zhang QG，Li CH，et al．Activati on of extracellular signalregulated kinase 5 may play a neuroprotective role in hippocampal CA3/DG region after cerebral ischemia［J］．Neurosci Res，2005，80(3):391

［8］ Yan X B，Hou H L，Wu L M，et al．Lithium regulates hippocampal neurogenesis by ERK pathway and facilitates recovery of spatial learning and memory in rats after transient global cerebral ischemia［J］．Neuropharmacology，2007，53(4):487

［9］ Zhang QG，Wang RM，Khan M，et al．Role of Dickkopf－1，an antagonist of the Wnt/beta－catenin signaling pathway，in estrogen－induced neuroprotection and attenuation of tau phosphorylation［J］．Neurosci，2008，28(34):8430

［10］陽生光，蘇科，涂燕喜，等．改良式大鼠全腦缺血再灌注模型的制作及海馬回核因子－κB的表達研究［J］．Chinese General Practice，2010，13(6):2001

［11］ Diler AS，Ziylan YZ，Uzum G，et a1．Passage of spermid in across the blood－brain barrier in short recirculation periods following global cerebral ischemia:effects of mild hyperthermia［J］．Neurosci Res，2002，43(4):335

［12］ O＇Keefe J，Speakman A．Single unit activity in the rat hippocampus during a spatial memory task［J］．Exp Brain Res，1987，68(1):1

［13］ Chen M，Chen Q，Cheng XW，et al．Zn2+mediates ischemia induced impairment of the ubiquit in proteasome system in the rat hippocampus［J］．Neurochem，2009，111(5):1094

［14］ Ito Y，Ohkubo T，Asano Y，et al．Nitric oxide production during cerebral ischemia and reperfusion in eNOS and nNOS knockout mice［J］．Curr Neurovasc Res，2010，7(1):23

［15］陳遠壽，陳 旻，張 弛．小鼠全腦缺血再灌注模型的制備及評價［J］．中國老年學雜志，2011，31(3):435

［16］ Clark WM，Madden KP，Rothlein R，et al．Reduction of central nervous system ischemic injury in rabbits using leukocyte adhesion antibody treatment［J］．Stroke，2006，28(2):78

［17］ Hillis AE，Barker PB，Beauchamp NJ，et al．MR perfusion imaging reveals regions of hypoperfusion associated with aphasia and neglect［J］．Neurology，2000，55:782

［18］李煒如，姚裕家，曾珍，等．MK801缺氧缺血性大腦皮質神經細胞鈣超載影響的研究［J］．中華兒科雜志，1999，37(2):85

［19］王國華，姜正林，李 霞，等．甘氨酸受體激動劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用［J］．臨床神經病學雜志，2010，23(1):38

［20］ Matin P，Moron F，Lombard G，et al．Ultra structural and biochemical studies on the neuroprotective effects of excitatory amino acid antagonists in the ischemic rat retina［J］．Exp Neurol，1997，146:419

［21］ Boast CA，Gerhardt SC，Pastor G，et al．The N －methyl－ D － aspartate antagonist CGS 19755 and CPP reduce ischemic damage in gerbils［J］．Brain Res，1988，442:345

［22］ 王小芳，楊光中．NMDA受體甘氨酸位點拮抗劑研究的新進展［J］．國外醫(yī)學藥學分冊，1999，26(3):129

［23］ Morris RG，Anderson E，Lynch GS，et al．Selective impairment of learning and blockade of long－term potentiation by an N－methyl－D－aspartaten receptor antagonist，AP5［J］．Nature，1986，319:774

［24］ Wang CX，Shuaib A．NMDA/NR2B selective antagonists in the treatment of ischemic brain injury［J］．Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2005，4:143

［25］ Ikonom idou C，Tursk iL．Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury［J］．Lancet Neurol，2002，1:383