應(yīng)用SEFA－PCR擴(kuò)增刺五加內(nèi)生青霉鯊烯合酶基因的旁鄰序列

朱金麗 何 閃 周 秘 修樂山 邢朝斌

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北唐山 063000)

刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)根、莖、葉均可入藥，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥用植物［1］，具增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞、抗衰老、抗輻射等藥理活性［2］。刺五加中主要含有三萜類、黃酮類、多糖等成分［3］，其中三萜類化合物均通過依賴甲羥戊酸的類異戊二烯途徑合成，鯊烯和2，3－氧化鯊烯是其共同的前體物質(zhì)［4］。鯊烯合酶(squalene synthase，SS)催化類異戊二烯途徑的第一步酶促反應(yīng)，是三萜類化合物生物合成的關(guān)鍵酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，催化兩分子的法呢?；姿?farnesyldiphosphate，F(xiàn)PP)縮合成為一分子鯊烯［5］。SS基因的過量表達(dá)能促進(jìn)甾醇和三萜類化合物的大量合成［6］。因此SS是此類物質(zhì)合成中公認(rèn)的一個限速酶［7］。

Penicillium minioluteum P116－1a是刺五加體內(nèi)豐富的內(nèi)生菌之一，該菌可顯著提高刺五加中的皂苷含量［8，9］。在刺五加的三萜皂苷生物合成所必須的類異戊二烯途徑中，因P．minioluteum P116－1a不能獨立合成三萜類化合物［10］，且甾醇類化合物為細(xì)胞的必須組分，因此，從甲羥戊酸至鯊烯的酶促反應(yīng)步驟共存于P．minioluteumP116－1a和其宿主刺五加中，而此后的三萜類合成過程為刺五加所特有。在這些共有的催化酶類中，SS是公認(rèn)的三萜皂苷合成的限速酶［7］。馮麗玲［11］等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的SS可利用青蒿的FPP合成甾醇，抑制其表達(dá)后則可促使FPP進(jìn)入青蒿素合成途徑，即一個物種的SS可以催化另一物種的FPP。因此P．minioluteum P116－1aSS也能夠催化刺五加FPP的可能性較大，研究其提高宿主刺五加中皂苷含量的作用機(jī)制具有重要意義。本文采用self－formed adaptor PCR(SEFA－PCR)染色體步移法對這個基因的DNA序列3＇和5＇端進(jìn)行了的擴(kuò)增，為進(jìn)一步研究P．minioluteum P116－1a SS旁鄰序列在刺五加苷生物合成中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 刺五加內(nèi)生青霉菌種P．minioluteum P116－1a菌株由本實驗室分離、鑒定，并甘油凍存法保存在－70℃。LATaq DNA聚合酶(TAKARA公司)，PGM－T克隆試劑盒，TOP－10大腸桿菌感受態(tài)，dNTP，瓊脂糖，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，D2000 DNA marker(天根生化科技有限公司)。其他為國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PAGE純化。H1650－W冷凍高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，F(xiàn)luorChem SP凝膠成像系統(tǒng)(美國 Alpha innotech)，TC－412 PCR儀(TECHNE公司)，SHA－C恒溫水浴搖床(金壇市榮華儀器制造有限公司)，WH－300－LCD電泳儀(上海伊瑞生物科技儀器有限公司)，PP－15－P11 PH計(Sartorius)。

1．2 方法

1．2．1 P．minioluteum P116－1a的培養(yǎng)。①制備 200mL 液體馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L)。②把做好的培養(yǎng)基分裝到三角餅中，每瓶20mL，用封口膜封好倒入馬鈴薯培養(yǎng)基的三角瓶。③把封好的培養(yǎng)基121℃高壓30min。④待培養(yǎng)基溫度降低至室溫，在培養(yǎng)基中接種P．minioluteum P116－1a。⑤把接菌的培養(yǎng)基于28℃，120r/min震蕩培養(yǎng)1周。

1．2．2 P．minioluteum P116－1a DNA 的提取。采用改良的CTAB法提取P116－1a DNA。①液氮研磨0．5g菌體，將粉末轉(zhuǎn)入 65℃ 預(yù)熱的 5mL CTAB 抽提液(2%CTAB，1．4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0．1mol/L Tris－ HCl，0．5mmol/L 亞精胺。用前加入0．1% β－巰基乙醇)中，震蕩混勻，分裝至1．5mL EP管中，每管700μL，65℃水浴1h。②冷卻至室溫后，加入等體積飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻靜置10min，12 000r/min，4℃離心10min，取上清到新的離心管中。重復(fù)抽提4～5次，到無雜質(zhì)為止。③取上清到新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，渦旋混合，靜置 5min。12 000r/min，4℃離心10min。④取上清，加入2倍體積－20℃預(yù)冷的無水乙醇，－20℃靜置20min，12 000r/min，4℃離心5min。⑤棄上清，沉淀用75%的乙醇漂洗2次。⑥棄上清，放置無液滴為止。⑦加入30μL無菌水溶解沉淀，－20℃保存。

1．2．3 SEFA －PCR 法擴(kuò)增 P．minioluteumP116－1a SS基因。參照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院微生物系王世明博士設(shè)計開發(fā)的SEFA－PCR［12］，根據(jù)本實驗室已克隆的 P．minioluteum P116－1a SS基因DNA序列(GenBank登錄號:JN853775，另文發(fā)表)設(shè)計引物。

3＇端擴(kuò)增引物:

P3SP1:5＇－ GTACTCGTCGGAACCATGTCACTGCAAAT －3＇;

P3SP2:5＇－ CAAGACAAGGAATCCTGGGAAGACATTAA － 3＇;

P3SP3:5＇－ TTCCGACCGCCTAATANNNNNNNNNATGGAG －3＇;

3＇端 SEFA－PCR第一步擴(kuò)增反應(yīng)體系:3 μL 10×LA Taq BufferⅡ，4．8 μL 2．5 mmol/L dNTPs，0．3 μL LA Taq 聚合酶，1 μL 模板 DNA，0．5 μL 引物 P3SP3，20．4 μL 水，總體系 30 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，40 ℃ 3 min，以 0．2℃/s的速度升溫至70℃，70℃ 5 min，一個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管加入1 μL引物P3SP1混勻后繼續(xù)進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為:94℃ 30 s，70℃ 6 min，共25個循環(huán);之后94℃ 30 s，70 ℃ 6 min，2 個循環(huán)，94℃ 30 s，50℃ 30 s，一個循環(huán)，上述2 次程序共計運(yùn)行8個循環(huán);最后70℃補(bǔ)充延伸10 min。SEFAPCR 第二步擴(kuò)增反應(yīng)體系:3 μL 10 × LA Taq BufferⅡ，4．8 μL 2．5 mmol/L dNTPs，0．3μL LA Taq 聚合酶，1μL 引物 P3SP2，1．5 μL第一步 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，19．4 μL 的水，總體系 30 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán);72℃ 10 min。

5＇端擴(kuò)增引物:

P5SP1:5＇－TAGGTAGAAGACGGTGACGGCAACGAGCAA－ 3＇;

P5SP2:5＇－GGAGGGTTGTGCCATACTTTCCTGTAGATC －3＇;

P5SP3:5＇－TGTAGTAGGCGATGTNNNNNNNNNAACCCA－ 3＇;

5＇端 SEFA－PCR第一步擴(kuò)增反應(yīng)體系:3 μL 10×LA Taq BufferⅡ，4．8 μL 2．5 mmol/L dNTPs，0．3 μL LA Taq 聚合酶，1 μL 模板 DNA，0．5 μL 引物 P5SP3，20．4 μL 水，總體系 30 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，40 ℃ 3 min，以 0．2℃/s的速度升溫至70℃，70℃ 5 min，一個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管加入1 μL引物P5SP1混勻后繼續(xù)進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為:94℃ 30 s，70℃ 6 min，共25個循環(huán);之后94℃ 30 s，70 ℃ 6 min，2 個循環(huán)，94℃ 30 s，50℃ 30 s，一個循環(huán)，上述2 次程序共計運(yùn)行8個循環(huán);最后70℃補(bǔ)充延伸10 min。SEFAPCR 第二步擴(kuò)增反應(yīng)體系:3 μL 10 × LA Taq BufferⅡ，4．8 μL 2．5 mmol/L dNTPs，0．3μL LA Taq 聚合酶，1μL 引物 P5SP2，1．5 μL第一步 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，19．4 μL 的水，總體系 30 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán);72℃ 10 min。

2 結(jié)果

2．1 刺五加內(nèi)生青霉 P．minioluteumP116－1a的培養(yǎng) P．minioluteumP116－1a在液體馬鈴薯培養(yǎng)基于28℃水浴搖床中，長勢良好，無變異，可用于后續(xù)研究。

2．2 P．minioluteumP116－1a DNA的提取 采用改良的CTAB法提取P．minioluteumP116－1a DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳后條帶清晰，無蛋白質(zhì)、多糖等的污染，無降解、結(jié)構(gòu)完整，見圖1，適于進(jìn)行染色體步移。

圖1 Penicillium minioluteum P116－1a DNA電泳結(jié)果

2．3 SEFA－PCR法擴(kuò)增P．minioluteum P116－1a鯊烯合酶基因3＇端和5＇端 根據(jù)已獲得的P．minioluteum P116－1a SS基因的DNA序列，利用primer 5軟件設(shè)計3＇端SEFA－PCR法染色體步移的引物P3SP1、P3SP2和P3SP3和5＇端擴(kuò)增引物P5SP1、P5SP2和P5SP3，以P．minioluteum P116－1a的DNA為模板，分別向3＇端和5＇端進(jìn)行SEFA－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示。由圖可知，經(jīng)過兩步擴(kuò)增后，分別在3＇端得到一條長約5 000 bp，5＇端得到一條長約3 000 bp的單一、清晰條帶。

圖2 P116－1a SS基因SEFA－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

自Cruickshank［13］利用Monilinia fructicola提高菜豆細(xì)胞中菜豆素(phaseollin)的含量后，利用真菌誘導(dǎo)提高藥用植物中天然產(chǎn)物產(chǎn)率的研究受到越來越多的關(guān)注。同屬五加科的西洋參［14］、人參［15］等先后分離到可提高其皂苷含量的真菌菌株。對刺五加而言，本實驗室已經(jīng)克隆得到可顯著提高其皂苷含量的真菌菌株P(guān)．minioluteumP116－1a的SS cDNA及DNA序列(另文發(fā)表)。內(nèi)生菌表達(dá)酶類催化宿主底物的實驗結(jié)果表明，一個物種的SS可以催化另一物種的FPP，抑制SS表達(dá)后則可促使FPP進(jìn)入其他合成途徑［11］。三萜皂苷生物合成中，P．inioluteumP116－1a與刺五加共有的代謝途徑為甲羥戊酸至鯊烯部分。此部分中，被公認(rèn)的三萜皂苷合成限速酶僅SS一個，同時對回接該菌后刺五加SS基因表達(dá)分析的結(jié)果表明，回接前后刺五加SS基因表達(dá)改變不具有統(tǒng)計學(xué)意義(另文發(fā)表)，而刺五加的三萜皂苷含量顯著提高。因此P．minioluteum P116－1a SS通過催化宿主刺五加提供的底物FPS，間接提高刺五加中皂苷含量的可能性較大。

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增擴(kuò)增已知基因的旁鄰序列有多種方法，包括反向 PCR(ReversePCR)、TAIL－PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)等，但是反向PCR涉及到酶切、連接等復(fù)雜的操作，由于真菌組織中富含多糖和其他次生代謝產(chǎn)物，所提取的DNA的酶切效果通常不佳，因此，擴(kuò)增效果難以保證，而TAILPCR需要進(jìn)行三輪PCR，且難以控制、假陽性多［16］。為了進(jìn)一步闡明刺五加內(nèi)生青霉P．minioluteum P116－1a SS在其宿主刺五加三萜類化合物代謝中的作用，我們利用在TAIL－PCR基礎(chǔ)改良創(chuàng)建的SEFA－PCR法成功擴(kuò)增得到5 000 bp的3＇端序列和3 000 bp的3＇端序列。但由于獲取到的序列長度過長，再連接入PGM－T載體進(jìn)行測序時，未能連接成功。同時由于SEFA－PCR法擴(kuò)增過程中，DNA序列需要自我打環(huán)，并作為自身引物［12］，因此獲得的序列兩端完全一致，致使不能進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接測序。目前我們正在嘗試使用其他T載體進(jìn)行連接。

刺五加內(nèi)生青霉P．minioluteum P116－1a SS基因旁鄰序列長片段的成功克隆，為揭示該基因?qū)λ拗鞔涛寮尤祁惢衔锷锖铣傻挠绊懠皟?nèi)生菌提高藥用植物中藥用成分含量的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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