10種常見中草藥水提物對(duì)嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1的體外抑菌效果研究

趙蓓蓓，趙 晶，王志錚，呂敢堂，何 凱

（浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316004）

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophia系自然界中具復(fù)雜血清型且易于變異的常在菌，廣泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和人的糞便中[1]，有致病性和非致病性菌株之分。其中，致病性嗜水氣單胞菌可感染人和各種動(dòng)物，據(jù)統(tǒng)計(jì)該菌對(duì)淡水魚類的感染率達(dá)90%以上，死亡率達(dá)65%以上，流行遍及我國20多個(gè)省市[2]，屬典型的人-獸-魚共患病病原菌[3]。

目前對(duì)由致病性嗜水氣單胞菌感染引起的水產(chǎn)動(dòng)物相關(guān)疾病的防控和治療，仍主要依賴傳統(tǒng)的化學(xué)消毒劑、抗生素[4]。因長期使用，不僅使該致病菌的耐藥性不斷增強(qiáng)[5]，而且也導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留量日趨增多[6]。新興免疫增強(qiáng)劑[7-8]、益生菌劑[9]、疫苗[10]等雖對(duì)防控嗜水氣單胞菌病有一定的效果，但其使用的局限性、對(duì)生物體的刺激性及操作的復(fù)雜性阻礙了它們的廣泛應(yīng)用，這也是導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物嗜水氣單胞菌病難以有效防除和根治的重要原因之一。

近期研究表明，中草藥對(duì)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物具有免疫、抗菌雙向調(diào)節(jié)作用[11]，且易降解、無殘留、無毒副作用[12]，是一類極具開發(fā)前景的純天然漁藥資源。國內(nèi)學(xué)者就中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五倍子、黃芩、蒲公英、板藍(lán)根等常見中草藥對(duì)致病性嗜水氣單胞菌有較好的抑制效果[13-16]，而關(guān)于中草藥復(fù)方對(duì)該菌防控效果的定量研究迄今尚未見報(bào)道。為從定量水平明晰中草藥組合對(duì)該菌的抑菌效果，找尋對(duì)該菌具協(xié)同抑菌效應(yīng)的中草藥組合，本研究采用瓊脂稀釋法從10種常見中草藥中篩選出對(duì)致病性嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1具較強(qiáng)抑菌效果的單方，并通過兩兩組配，觀察了各中草藥組合對(duì)該菌的抑菌作用，以期為水產(chǎn)動(dòng)物嗜水氣單胞菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌及菌液制備

嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1（Genbank登錄號(hào)：GU5639920），由浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室安全養(yǎng)殖分室提供。將其接種于無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)20 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將已知菌濃度的菌液配成含15%甘油的混合液保存于-80℃冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)中草藥及藥平板的制備

實(shí)驗(yàn)用中草藥蒲公英Taraxacum officnala、黃連Coptis chinensis、黃芩Scutellaria baicalensis、金銀花Lonicera japonica、五倍子 Rhus chinensis、穿心蓮 Andrographis paniculata、魚腥草 Houttuynia cordata、連翹Forsythia suspensa、大青葉Folium isatidis和板藍(lán)根Isatidis Radix等均為由陜西中鑫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的10倍水提物粉劑（粒徑小于等于0.2 mm，本文所涉及藥液濃度均換算為單倍計(jì)算）。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定各單方藥平板的初始含藥量（基礎(chǔ)培養(yǎng)基為水解酪蛋白培養(yǎng)基，其成分為牛肉浸出粉30 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酪蛋白水解物 17.5 g/L，瓊脂 17 g/L；pH 為 7.3±0.2，購自杭州微生物試劑有限公司），通過倍比稀釋制成梯度含藥平板。

1.3 實(shí)驗(yàn)中草藥體外抑菌效果的觀察

依據(jù)實(shí)驗(yàn)菌致中華鱉稚鱉感染與致死的定量研究結(jié)果[17]，本研究將該菌的實(shí)驗(yàn)濃度梯度依次設(shè)置為1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×106CFU/mL 和 1.0×107CFU/mL。同一梯度含藥平板僅均勻涂布某一實(shí)驗(yàn)菌濃度梯度，涂布菌量為100 μL，每塊含藥平板重復(fù)2次，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以實(shí)驗(yàn)平板上無菌落生長的最小中草藥濃度判為最小抑菌濃度。

1.4 中草藥兩兩組配的體外抑菌效果

基于實(shí)驗(yàn)菌致中華鱉稚鱉不表露臨床感染的最高注射菌量為1.0×104CFU/只[17]，故本研究將對(duì)1.0×104CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌濃度梯度具強(qiáng)抑菌效果中草藥的最小抑菌濃度計(jì)為1個(gè)抑菌強(qiáng)度單位，并按A,0.2A+0.8B，0.4A+0.6B，0.6A+0.4B，0.8A+0.2B，B 進(jìn)行兩兩組配(A、B 分別為兩種單方的最小抑菌濃度，本研究將同一實(shí)驗(yàn)菌濃度梯度水平下A、B實(shí)驗(yàn)組中抑菌作用的最強(qiáng)者視為對(duì)照組)，制作含藥平板，觀察它們對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的體外抑菌效果（實(shí)驗(yàn)菌濃度梯度設(shè)置為 1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×106CFU/mL 和 1.0×107CFU/mL）。同一實(shí)驗(yàn)菌濃度梯度水平中，以平均殘留菌量較對(duì)照組低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上者判為抑菌協(xié)同效應(yīng)，較對(duì)照組高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上者判為抑菌拮抗效應(yīng)，其余判為相互獨(dú)立作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的體外抑菌效果

列實(shí)驗(yàn)菌不同濃度梯度中草藥單方的最小抑菌濃度于表1。由表1可見，10種中草藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑菌作用由強(qiáng)至弱依次為五倍子、黃芩、金銀花、蒲公英、連翹、黃連、穿心蓮、魚腥草、板藍(lán)根和大青葉，五倍子、黃芩、金銀花、蒲公英對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他6種中草藥，尤以五倍子為佳，四者對(duì)1.0×104CFU/mL 濃度菌液的最小抑菌濃度（MIC）分別為：0.20 mg/mL、1.56 mg/mL、1.56 mg/mL 和 3.12 mg/mL。

表1 10味中草藥單方對(duì)不同濃度菌液的最小抑菌濃度MIC（mg/mL）Tab.1 The minimal inhibitory concentration of ten Chinese herb for differernt concerntrention

2.2 中草藥兩兩組合對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的體外抑菌效果

由表2可見，（1）實(shí)驗(yàn)菌濃度1.0×107CFU/mL時(shí)，蒲公英-黃芩、黃芩-金銀花、蒲公英：黃芩=3:2和黃芩：五倍子≥3:2組合均表現(xiàn)為抑菌協(xié)同效應(yīng)，蒲公英-五倍子、金銀花-五倍子兩組合均表現(xiàn)為抑菌相互獨(dú)立作用；（2）實(shí)驗(yàn)菌濃度1.0×106CFU/mL時(shí)，蒲公英-黃芩、黃芩-金銀花、蒲公英：金銀花≤3:2和黃芩：五倍子≥3:2組合均表現(xiàn)為抑菌協(xié)同效應(yīng)，而蒲公英-五倍子、金銀花-五倍子兩組合則均表現(xiàn)為抑菌拮抗效應(yīng)；（3）實(shí)驗(yàn)菌濃度1.0×105CFU/mL時(shí)，蒲公英-黃芩、黃芩：五倍子≥2:3組合均表現(xiàn)為抑菌相互獨(dú)立作用，黃芩-金銀花、蒲公英：金銀花≤3:2組合均表現(xiàn)為抑菌協(xié)同作用，而蒲公英-五倍子、金銀花-五倍子組合均表現(xiàn)為抑菌拮抗效應(yīng)；（4）實(shí)驗(yàn)菌濃度1.0×104CFU/mL時(shí)，蒲公英-黃芩、黃芩-金銀花、蒲公英：金銀花≤3:2和黃芩：五倍子≥2:3組合均表現(xiàn)為抑菌相互獨(dú)立作用，蒲公英-五倍子，金銀花-五倍子兩組合均表現(xiàn)為抑菌拮抗作用。

表2 4種中草藥兩兩組配的體外抑菌效果（mg/mL）Tab.2 The effect of bacterial inhibition for differernt compose of two Chinese herb

3 討論

中草藥單方對(duì)細(xì)菌的抑菌效果強(qiáng)弱與中草藥的有效抑菌成分及實(shí)驗(yàn)菌的種類有關(guān)。本研究10種中草藥對(duì)革蘭氏陰性桿菌均有一定的抑菌作用。其中五倍子的主要抑菌成分為沒食子酸和鞣酸，鞣酸對(duì)蛋白質(zhì)具沉淀作用[18]；黃芩的主要化學(xué)成分為黃芩素和黃芩苷[19]，可以作用于酶系統(tǒng)或功能蛋白[20]；蒲公英的主要抑菌成分為萜類、黃酮類-木犀草素[21]，其抑菌機(jī)制主要是通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，進(jìn)而影響菌體核酸及蛋白質(zhì)的合成[22]；金銀花主要抑菌成分為綠原酸、異綠原酸等[23]；連翹則主要借助其種子的揮發(fā)油起抑菌作用[24]；有學(xué)者從魚腥草內(nèi)也提取到一種類似揮發(fā)油成分，黃連的有效抑菌成分為小檗堿，其對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果；板藍(lán)根和大青葉均含靛藍(lán)、靛玉紅等，對(duì)痢疾桿菌有一定的抑菌效果[18]。

姜巨峰等[25]指出五倍子對(duì)嗜水氣單胞菌具極強(qiáng)的體外抑菌作用，當(dāng)菌濃度2.5×107CFU/mL時(shí)，其最小抑菌濃度僅為0.78 mg/mL；李茜等[26]認(rèn)為蒲公英能有效抑制嗜水氣單胞菌的生長；高漢嬌等[13]發(fā)現(xiàn)黃芩、蒲公英、金銀花對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌作用呈黃芩＞蒲公英＞金銀花；另有研究表明，在嗜水氣單胞菌1.0×104CFU/mL時(shí)黃連、連翹、大黃、魚腥草、大青葉對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌作用呈黃連＞連翹＞大黃＞魚腥草＞大青葉[27]；上述與本研究10種中草藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的體外抑菌作用呈五倍子＞黃芩＞金銀花＞蒲公英＞連翹＞黃連＞穿心蓮＞魚腥草＞板藍(lán)根＞大青葉的結(jié)果基本一致。至于，宋學(xué)宏等[28]采用中草藥醇提物對(duì)嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株的抑菌作用呈板藍(lán)根＞蒲公英，與本研究結(jié)果相異，可能是由提取方法的不同引起的。

張文青等[29]研究發(fā)現(xiàn)兒茶、五倍子、五味子和烏梅按4:2:4:1和1:2:2:4的比例配伍時(shí)對(duì)嗜水氣單胞菌分別具最佳的抑菌和殺菌作用。表明中草藥復(fù)方的抑菌效果不僅取決于各單方的有效抑菌成分，還與藥物間的相互作用及配伍比例密切相關(guān)。鄭曙明[30]在分析一例五倍子復(fù)方的抑菌藥效時(shí)指出，該復(fù)方中五倍子的主要抗菌成分沒食子酸含量最高，達(dá)10.47%，其次是黃酮類中的槲皮素和黃芩苷，且黃芩苷的抑菌效果大于槲皮素，而黃芩苷來源于復(fù)方中的黃芩，表明五倍子與黃芩組配對(duì)嗜水氣單胞菌有較好的抑菌協(xié)同效果。本研究中黃芩：五倍子≥3:2時(shí)對(duì)1.0×106～1.0×107CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌表現(xiàn)為抑菌協(xié)同效應(yīng)，黃芩：五倍子≥2:3時(shí)對(duì)1.0×104～1.0×105CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌表現(xiàn)為抑菌相互獨(dú)立作用，既印證了鄭曙明[30]分析結(jié)果的可靠性，也揭示了五倍子、黃芩組配比例對(duì)抑菌效果的重要性，即兩者只有在一定的配比條件下才具有抑菌協(xié)同效果。至于，本研究蒲公英-黃芩、黃芩-金銀花兩組合的各組配比例對(duì) 1.0×106～1.0×107CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌均表現(xiàn)為抑菌協(xié)同效應(yīng)，而蒲公英-五倍子，金銀花-五倍子兩組合的各組配比例對(duì)1.0×104～1.0×106CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌均表現(xiàn)為抑菌拮抗效應(yīng)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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