廣西地區(qū)原發(fā)性肝細胞癌患者甲胎蛋白基因多態(tài)性檢測及其臨床意義分析

莫國輝，黃健旅，梁 毓，黎殿德，于 龍，劉征濤，齊魯楠，覃 曉，彭民浩，肖開銀，李佳荃，吳華，彭 濤△

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽血管外科;2.廣西醫(yī)科大學科學實驗中心，廣西 南寧 530021)

檢測甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)是目前我國最常用的肝癌血清腫瘤標志物之一［1］。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在采取不同的診斷閾值時，AFP對診斷HCC的特異性高，而敏感性不足。因此，AFP對肝癌的診斷準確度一直不能令人滿意［2－3］。本課題組前期進行了影響廣西健康人群的血清腫瘤學標志物水平的全基因組定量性狀連鎖分析關(guān)聯(lián)研究，獲得與AFP水平相關(guān)并達到全基因組統(tǒng)計學顯著水平的單核基因多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphisms，SNPs)三 個 (候 選 基 因rs12506899、rs16849384位于 AFP基因;候選基因rs7688274位于白蛋白基因)。我們在本研究中探討前期獲得的影響健康人群血清AFP水平的候選基因型是否與原發(fā)性肝細胞癌人群中的血清AFP水平以其臨床病理參數(shù)存在關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗選取2005年3月至2011年10月在廣西醫(yī)科大學一附院及廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院診斷為原發(fā)性肝細胞癌患者177例(本實驗所取標本均經(jīng)患者同意及醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準)。其中男性165例，女性12例。年齡范圍為27～78歲，中位年齡為46歲。術(shù)前獲得患者的血清AFP水平及相關(guān)臨床資料。所有患者術(shù)后均進行隨訪追蹤，隨訪時間為2005年3月至2012年3月，中位隨訪時長為17個月。排除標準:術(shù)后病理為膽管細胞癌及混合細胞型肝癌者;復發(fā)肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌及術(shù)前行經(jīng)肝動脈治療者(包括TAI，TAE，TACE);腫瘤直徑大于5 cm者。

1.2 主要試劑及探針

組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，F(xiàn)astStart Universal Probe Master(Rox)購自美國羅氏公司。探針和引物是根據(jù)在NCBI SNP公開發(fā)表SNP位點信息，定購由美國ABI公司的Assay－by－DesignTM－service設計的全套探針和引物，探針分別用FAM和VIC標記(表1)。

表1 探針信息

1.3 組織DNA提取

組織DNA提取按天根公司試劑盒操作說明書進行。用Thermo公司生產(chǎn)的NANODROP2000超微量分光光度計測定DNA溶液在260 nm和280 nm處的吸光度及其比值(OD值)與DNA濃度。A260 nm/A280 nm 為 1.7～1.9，此值說明:DNA 純度符合PCR的要求。并調(diào)整DNA濃度至20 ng/μL，分裝保存。

1.4 基因型檢測

基因型檢測采用美國ABI公司生產(chǎn)的StepOne-Plus Real-Time PCR System分析平臺。每個PCR反應體系總體積為 25 μL，包含 FastStart Universal Probe Master(Rox)12.5 μL，SNP Genotyping Assay 0.625 μL，20 ng/μL 基因組 DNA 1 μL，DNase/RNase-Free ddH2O 10.875 μL。 基 因 型 檢 測 按StepOnePlus Real-Time PCR System操作說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果

位點rs12506899在全部177例樣本中，測出純合子T/T 80例，純合子G/G 29例，雜合子G/T 49例，未測出19例。位點rs16849384在全部177例樣本中，測出純合子C/C 41例，純合子T/T 54例，雜合子C/T 54例，未測出28例。位點rs7688274在全部177例樣本中，測出純合子A/A 78例，純合子G/G 27例，雜合子C/T 35例，未測出37例(圖1、圖2、圖3)。

2.2 統(tǒng)計量計算及生存分析結(jié)果

經(jīng)成組設計秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，三候選位點各基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學意義。在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，同時合并肝硬化的患者與無肝硬化的患者術(shù)前AFP水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。其中，在有乙肝背景的HCC患者中，無肝硬化與肝硬化組的AFP水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。其中無肝硬化組的AFP水平高于肝硬化組。而在無乙肝背景的HCC患者中，無肝硬化組與肝硬化組的AFP水平差異無統(tǒng)計學意義(表2、表3)。

生存分析結(jié)果提示不同P53抗體水平對患者無瘤生存時間有影響(P=0.010)。其中P53抗體陽性程度越高者無瘤生存時間越短，見圖4。

表2 肝硬化與AFP水平的相關(guān)分析

表3 肝硬化與乙肝不同暴露情況對AFP水平的影響

3 討論

AFP的病理性升高可見于肝細胞的再生和惡性腫瘤。研究報道肝癌患者的AFP水平比健康人群增加高達195倍［4］，但是臨床仍有約30%的AFP陰性HCC患者成為應用AFP篩查和診斷HCC的盲區(qū)［5］。本研究中，影響廣西正常人群AFP水平的候選基因型對HCC患者AFP水平的影響無統(tǒng)計學意義，提示可能在正常人群中影響AFP水平的遺傳機制有別于HCC人群或者在HCC人群中貢獻度不大，也不能解釋臨床上約30%的HCC患者AFP陰性的原因。

本研究發(fā)現(xiàn):在有乙肝背景的HCC患者中，無肝硬化組與肝硬化組的AFP水平差異有統(tǒng)計學意義，其中無肝硬化組的AFP水平高于肝硬化組。而在無乙肝背景的HCC患者中，無肝硬化組與肝硬化組的AFP水平差異無統(tǒng)計學意義。進一步對患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平進行分析，見表4、表 5。

表4 有無肝硬化分組間ALT水平的比較

表5 肝硬化與乙肝不同暴露情況分組間ALT水平的比較

結(jié)果顯示，無肝硬化組和肝硬化組患者的ALT水平差異有顯著性，其中在有乙肝背景的患者中無肝硬化組的ALT水平要顯著高于肝硬化組。這說明無肝硬化組患者可能存在活動性肝炎等肝功能受損情況，導致肝細胞的再生水平高于無肝硬化組，AFP水平亦顯著高于無肝硬化組。

國內(nèi)有研究［6］表明:慢乙肝、飲酒、年齡及肝功能(包括ALT，AST，總膽紅素和直接膽紅素)均可導致AFP水平異常(＞20 ng/mL)。肝炎患者肝細胞再生活躍，血清中AFP含量則明顯升高，其機制是肝細胞受感染后的急性反應，提示肝細胞的再生過程，是新生肝細胞幼稚化現(xiàn)象［7］。本研究中所得結(jié)果與上述文獻報道是一致的。

目前已經(jīng)明確P53基因丟失或突變，可誘發(fā)多種癌變［8］。通常認為，P53抗體陽性提示腫瘤惡性生物學行為［9］。高志勇等［10］研究發(fā)現(xiàn)，正常人、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者和肝細胞癌患者血清中 P53抗體陽性率分別為 0.65%(3/465)、2.46%(6/244)、5.47%(7/128)和 10.26%(12/117)，有逐漸升高的趨勢。本實驗結(jié)果提示P53抗體陽性水平與HCC患者預后相關(guān)，且P53抗體陽性程度越高者預后越差。這與國內(nèi)外相關(guān)報道一致。

總之，本實驗通過嘗試在HCC患者中驗證候選基因與HCC患者的AFP水平是否存在相關(guān)性，探索AFP在HCC的診斷、治療及預后監(jiān)測中的具體調(diào)節(jié)機制。實驗結(jié)果提示候選位點基因型并不影響HCC患者的AFP水平及預后。結(jié)合目前相關(guān)研究表明:現(xiàn)階段基因型檢測并不能代替AFP作為HCC早期診斷和篩查的手段。

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［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011版)［Z］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)［2011］121號)，2011

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