尿液腎損傷分子1:預(yù)測梗阻性腎病腎臟預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物

謝園園 牟 姍 薛 蔚 蔣 晨 徐維佳 倪兆慧

根據(jù)The North American Pediatric Renal Transplant Cooperative Study (NAPRTCS)的數(shù)據(jù)顯示[1-3],梗阻性腎病是導(dǎo)致成人急性腎損傷(AKI)的主要原因之一。梗阻性腎病起初腎功能緩慢下降,一旦發(fā)生AKI，患者腎功能會出現(xiàn)急劇惡化。在疾病早期發(fā)生AKI可能會加速疾病的進(jìn)程,更早進(jìn)入終末期腎病(ESRD)[4]。目前臨床上采用的傳統(tǒng)的AKI診斷標(biāo)志物——血清肌酐(SCr)或尿量標(biāo)準(zhǔn)在診斷時間上往往存在一定滯后性,有礙于臨床的早期預(yù)防和干預(yù)[5]。近年來,早期預(yù)測AKI發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物已成為AKI研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),其中包括一些反映腎小管損傷的指標(biāo),如腎損傷分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白分子(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)。一些實(shí)驗(yàn)室及臨床研究已發(fā)現(xiàn)KIM-1和NGAL可較早預(yù)測AKI的發(fā)生,但是在梗阻性腎病所致AKI中的應(yīng)用尚缺乏臨床研究。在梗阻性腎病的發(fā)展過程中,KIM-1、NGAL能否作為疾病預(yù)后的評定指標(biāo),尚需進(jìn)一步探討。本研究通過比較、分析不同時間點(diǎn)尿液KIM-1(uKIM-1)、尿液NGAL(uNGAL)的水平,評估其在梗阻性腎病所致AKI中的診斷價值,并進(jìn)一步探討其作為預(yù)測腎臟預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)的潛在價值。

對象和方法

研究對象收集2010年8月至10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院住院的經(jīng)泌尿系超聲檢查、CT斷層掃描或腎臟核素掃描等診斷,手術(shù)明確的梗阻性腎病患者(年齡≥18歲、性別不限、臨床資料完整)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未成年患者；(2)尿毒癥且已行規(guī)律性血液透析、規(guī)律性腹膜透析的患者；(3)其他原因引起的AKI,存在免疫系統(tǒng)疾病、實(shí)體腫瘤或其他并發(fā)癥的患者；(4)臨床癥狀提示存在急慢性感染的患者。

尿液標(biāo)本留取所有患者在術(shù)前和術(shù)后4h、8h、12h、24h、48h及72h留取新鮮尿液各10 ml。離心機(jī)2 000 r/min離心15 min后取上清液置于Eppendorf管,于-80℃冰箱保存。

指標(biāo)檢測

uKIM-1測定 uKIM-1采用ELISA方法進(jìn)行檢測。試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本所對應(yīng)得濃度。所有uKIM-1濃度均用同步尿肌酐校正后以pg/(mg·Cr)表示。

uNGAL測定 uNGAL采用ELISA方法進(jìn)行檢測。試劑盒由荷蘭Hycult biotechnology公司生產(chǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本所對應(yīng)得濃度。所有uNGAL濃度均用同步尿肌酐校正后以ng/(mg·Cr)表示。

其他指標(biāo) 血清和尿肌酐濃度使用酶法檢測,采用MDRD公式估算腎小球?yàn)V過率(eGFR),eGFR=186×(SCr/88.4)-1.154×年齡-0.203×(0．742,女性)[6]。測量指標(biāo)還包括:血脂、全血細(xì)胞、血清白蛋白(Alb)、肝功能,24h尿蛋白定量、尿白蛋白(uAlb)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平等。

研究方法根據(jù)梗阻性腎病患者是否發(fā)生AKI,將患者分成AKI組及非AKI組。AKI定義為腎功能在48h內(nèi)突然減退,表現(xiàn)為SCr升高,絕對值≥26.4 μmol/L；或SCr較基礎(chǔ)值升高≥50%[7]。隨訪1年,根據(jù)患者腎功能情況將患者分成恢復(fù)組及未恢復(fù)組。腎功能恢復(fù)定義為SCr濃度降至AKI發(fā)生前的基礎(chǔ)水平或較基礎(chǔ)值升高<50%；或SCr水平保持在正常范圍。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。運(yùn)用ROC曲線及曲線下面積(AUC)對uKIM-1、uNGAL診斷AKI的敏感度和特異度進(jìn)行評價。COX多因素回歸分析影響患者腎臟預(yù)后的相關(guān)危險因素?；颊吣I臟存活率使用Kaplan-Meier生命生存曲線來進(jìn)一步分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

一般情況自2010年8月至10月間,共篩選51例患者,剔除存在并發(fā)癥且伴發(fā)感染17例、失隨訪4例，最終入選30例梗阻性腎病患者,平均年齡55.13±11.26歲(38～76歲)。男女比例為2.75∶1,其中男性22例(73.33%),平均年齡58.27±11.42歲；女性8例(26.67%),平均年齡:46.5±4.66歲。SCr水平為547 μmol/L(67.8～923 μmol/L),eGFR:7 ml/(min·1.73m2)[5～93 ml/(min·1.73m2)],24h尿蛋白總量:0 g/24h(0～1.98 g/24h),uAlb:88.22 mg/g(19.62～140.43 mg/g),uNAG:19.59 U/mg(14.93～55.64 U/mg),uKIM-1:432.32 pg/(mg·Cr)[165.40～700.00 pg/(mg·Cr)],uNGAL:456.03 ng/(mg·Cr)[211.97～1 312.53 ng/(mg·Cr)]。與正常值比較,梗阻性腎病患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血脂、血紅蛋白(Hb)、Alb等均在正常范圍(表1)。

表1 AKI組與非AKI組一般情況及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

AKI組與非AKI組間比較發(fā)生AKI患者18例,非AKI患者12例。二組間比較患者年齡、男女比例、24h尿蛋白總量、肝功能、血脂等水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AKI組uNAG、uAlb明顯高于非AKI組。非AKI組的血Hb、Alb水平高于AKI組。比較AKI組與非AKI組uKIM-1、uNGAL經(jīng)尿肌酐校正后的水平,AKI組明顯高于非AKI組(P<0.01)(表1)。

uKIM-1、uNGAL診斷梗阻性腎病所致AKI的準(zhǔn)確性分析Spearman相關(guān)分析uKIM-1與SCr呈正相關(guān)(r=0.497,P=0.002),與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.485,P=0.002)(圖1)。患者uNGAL水平與Scr呈正相關(guān)(r=0.553,P<0.001),與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.619,P<0.001)(圖2)。

ROC曲線分析顯示,uKIM-1的AUC為0.943,P=0.002。當(dāng)檢測的截點(diǎn)為338.26 pg/(mg·Cr)時,其診斷梗阻性腎病所致AKI的敏感度和特異度分別為90%和85.7%。uNGAL診斷AKI的AUC為0.900,P=0.006。當(dāng)檢測的截點(diǎn)為261.76 ng/(mg·Cr)時,其診斷的敏感度90%,特異度85.7%(圖3)。

圖3 uKIM-1、uNGAL與梗阻性腎病所致AKI的曲線下面積

影響腎臟預(yù)后的相關(guān)因素分析隨訪1年,觀察患者的腎功能情況,腎功能恢復(fù)組患者20例,未恢復(fù)組10例,兩組患者年齡、男女比例、24h尿蛋白總量、uNAG、肝功能、血脂等水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未恢復(fù)組uKIM-1、uNGAL、uAlb高于恢復(fù)組,Hb低于恢復(fù)組(P<0.05)。

觀察腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組不同時間點(diǎn)uKIM-1、uNGAL、SCr水平變化。結(jié)果顯示未恢復(fù)組術(shù)后72h uKIM-1水平顯著高于恢復(fù)組,術(shù)前、術(shù)后4h及72h uNGAL水平均顯著高于恢復(fù)組(圖4)。而比較兩組間SCr水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 1年后腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組各時間點(diǎn)uKIM-1、uNGAL水平變化

對腎功能未恢復(fù)組進(jìn)行逐步COX回歸分析結(jié)果顯示,術(shù)后72h uKIM-1是腎臟預(yù)后的危險因素(表2)，各時間點(diǎn)uNGAL水平與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。

ROC曲線分析預(yù)測腎臟預(yù)后的準(zhǔn)確性,術(shù)后72h uKIM-1曲線下面積為0.912,P=0.003。當(dāng)檢測的截點(diǎn)為100.23 pg/(mg·Cr)時,其敏感度和特異度分別為85.7%和84.6%(圖5)。當(dāng)術(shù)后72h出現(xiàn)uKIM-1>156.00 pg/(mg·Cr),與不良腎臟預(yù)后呈明顯相關(guān)性(圖6)。

表2 影響患者長期腎臟預(yù)后的相關(guān)危險因素

圖5 術(shù)后72h uKIM-1預(yù)測腎臟預(yù)后的曲線下面積

圖6 術(shù)后72h尿液腎損傷分子1(uKIM-1)與腎臟預(yù)后

討 論

梗阻性腎病是因尿流障礙而導(dǎo)致腎臟功能和器質(zhì)性損害的疾病。其主要機(jī)制是:(1)腎小管管腔擴(kuò)張、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡；(2)腎臟間質(zhì)炎癥；(3)球管失衡,逐漸間質(zhì)纖維化[8]。這三個過程相互作用,互相重疊,最后導(dǎo)致腎小管萎縮,腎臟間質(zhì)纖維化,腎單位缺失。梗阻性腎病一旦發(fā)生AKI,腎功能預(yù)后差,并最終進(jìn)展為ESRD。評估和管理梗阻性腎病患者的臨床挑戰(zhàn)在于選擇手術(shù)時機(jī)和確立判斷預(yù)后的指標(biāo)[9]。

KIM-1是一種跨膜蛋白,在正常腎臟中不表達(dá),AKI臨床研究和動物模型研究均顯示在腎臟病患者腎缺血和腎毒性損傷時腎近端小管細(xì)胞大量分泌KIM-1[10-13]。在腎近曲小管尖端處KIM-1濃度最高,尖端是腎小管最易受損的部位[14]。在臨床前實(shí)驗(yàn)[15],KIM-1已被證明是出色的腎毒性損傷標(biāo)志物,在13個不同的AIK模型研究中顯示,uKIM-1水平與腎小管損傷程度相關(guān)。尤其是輕微腎小管損傷時,uKIM-1較SCr、血尿素氮、uNAG更敏感。Liangos等[16]前瞻性研究觀察了103例心肺旁路術(shù)后的患者的KIM-1水平,結(jié)果顯示,心外科術(shù)后早期AKI患者KIM-1普遍較其他指標(biāo)提早2h升高。Zhang等[17]觀察62例患者的移植腎活檢發(fā)現(xiàn),在所有急性腎小管損傷及92%發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的患者腎組織KIM-1表達(dá)升高。本研究中,梗阻性腎病所致AKI組患者uKIM-1水平顯著升高,與eGRF水平呈負(fù)相關(guān),提示uKIM-1水平的升高,可反映eGFR的下降。uKIM-1診斷AKI的AUC達(dá)0.943。

Chaturvedi等[18]研究證實(shí),KIM-1的表達(dá)將持續(xù)存在,直至損傷的腎小管細(xì)胞完全修復(fù)。一項(xiàng)對不同病因的腎臟病患者進(jìn)行腎穿刺活檢的大規(guī)模臨床研究結(jié)果顯示,患者近端腎小管上皮細(xì)胞都分泌KIM-1,組織KIM-1的表達(dá)與纖維化和炎癥有關(guān)[19]。uKIM-1水平能反映組織KIM-1水平,與腎間質(zhì)炎癥和腎功能相關(guān)。這提示KIM-1不僅是急性腎近端小管損傷的生物學(xué)標(biāo)志物,也是腎小管間質(zhì)慢性炎癥及纖維化改變的標(biāo)志物。Waanders等[20]的一項(xiàng)回顧性研究顯示,非糖尿病蛋白尿患者進(jìn)行降蛋白尿治療后,尿液中KIM-1排泄下降,提示uKIM-1可能成為評價療效的指標(biāo)。uKIM-1可能是持續(xù)腎小管損害的無創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)志物。我們檢測梗阻性腎病患者不同時間點(diǎn)的uKIM-1水平變化,并對患者腎功能情況進(jìn)行了1年的隨訪發(fā)現(xiàn),解除梗阻術(shù)后72h的uKIM-1水平在腎功能未恢復(fù)患者及腎功能恢復(fù)患者間存在顯著差異,COX回歸分析顯示術(shù)后72h uKIM-1是腎臟預(yù)后的危險因素,與不良預(yù)后呈明顯相關(guān)性。

NGAL是一種分子量為25 kDa的蛋白質(zhì),主要由中性粒細(xì)胞分泌,近端腎小管細(xì)胞等各種上皮細(xì)胞也均可分泌[21]。正常的腎臟、肺、胃和結(jié)腸組織中NGAL表達(dá)較低,然而上皮細(xì)胞受到損害時NGAL表達(dá)顯著升高,主要是由腎小管上皮細(xì)胞分泌并釋放[10]。Mishra等[22]在缺血性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn),腎小管內(nèi)NGAL基因和蛋白的表達(dá)在短期內(nèi)出現(xiàn)大幅度升高,由此推測uNGAL可作為缺血性AKI的生物學(xué)標(biāo)志物。在小鼠動物模型研究和AKI的臨床研究中,利用基因芯片分析,證明NGAL是腎臟缺血和腎毒性損害后最早最顯著的敏感基因之一[23]。在一些臨床前試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),在AKI早期血和尿中即可檢出NGAL蛋白,這一改變早于腎臟的功能性改變[24]。許多臨床研究以NGAL作為AKI的生物學(xué)標(biāo)記,例如重癥監(jiān)護(hù)病房中AKI患者,心外科手術(shù)后和腎移植術(shù)后的AKI患者,觀察其血尿NGAL的升高和SCr的變化。用蛋白印跡分析測定NGAL,AKI患者2～6h內(nèi)NGAL水平升高超過10倍,而SCr在術(shù)后24～72h才上升基線值的50%。在這些研究中,血尿NGAL是AKI的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo),測量2h的血、尿NGAL的AUC為0.998和0.92[25]。本研究中,uNGAL的檢測截點(diǎn)為261.76 ng/(mg·Cr)時,其診斷AKI的AUC為0.90,敏感度和特異度分別為90%和85.7%。薈萃分析顯示,uNGAL不但有助AKI的早期診斷,并且還可用于預(yù)測患者是否需行腎臟替代治療及短期預(yù)后[26]。本研究隨訪1年,比較腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組間不同時間點(diǎn)uNGAL水平的變化發(fā)現(xiàn),未恢復(fù)組解除梗阻術(shù)前、術(shù)后4h及72h uNGAL水平均顯著高于恢復(fù)組,但是進(jìn)一步回歸分析顯示其與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。由于本研究樣本較小,uNGAL在預(yù)測腎臟預(yù)后中的價值有待進(jìn)一步研究。

NAG是細(xì)胞溶酶體內(nèi)水解酶之一,廣泛存在于人體各組織,腎組織中含量較高,尤多見于近曲小管上皮細(xì)胞。NAG也是近端腎小管損傷的生物學(xué)標(biāo)志物,目前已廣泛用于臨床[27,28]。本研究中,隨訪1年后腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組uNAG水平無明顯差異,與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。uNAG在近端腎小管發(fā)生結(jié)構(gòu)性損傷后才升高[29]。

本研究是一個單中心小樣本的研究,存在一些不足之處,僅隨訪了1年患者的腎功能變化,未進(jìn)一步隨訪uKIM-1和uNGAL水平的變化。因此,尚需更大樣本的多中心研究,同時隨訪腎臟疾病進(jìn)程中uKIM-1和uNGAL水平的變化,進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個生物學(xué)標(biāo)志物在監(jiān)測腎臟預(yù)后中的價值。

綜上所述,uKIM-1和uNGAL在梗阻性腎病所致AKI中診斷的準(zhǔn)確性較高,可作為臨床上AKI的診斷標(biāo)志物。同時,uKIM-1還能較準(zhǔn)確的預(yù)測梗阻性腎病患者的腎臟預(yù)后,可作為梗阻性腎病預(yù)后不佳的早期篩查指標(biāo),幫助臨床醫(yī)師及早對這類患者進(jìn)行干預(yù),防止疾病進(jìn)展。

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