骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠急性肺水腫病理學(xué)影響

解放軍第323醫(yī)院干三科（西安710054） 劉秋平 盧曉昭 費(fèi)晉秀 王黎明 王常利 趙亞玲 王 娟

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSC）是成體干細(xì)胞的一種，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在有核細(xì)胞中只占0.001%～0.01%［1］，在一定條件下可分化為多個(gè)胚層來(lái)源的組織細(xì)胞［2］。因此，干細(xì)胞移植有可替代受損細(xì)胞，成為治療多種疾病的有效方法。急性肺水腫見(jiàn)于多種疾病引發(fā)的并發(fā)癥，是多種發(fā)病機(jī)理的綜合效應(yīng)，是內(nèi)科急危重癥。本研究應(yīng)用氯化銨誘導(dǎo)建立大鼠急性肺水腫模型，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)防性移植及治療性移植對(duì)肺水腫病理學(xué)變化影響，為急性肺水腫預(yù)防治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 購(gòu)買(mǎi)廣州賽業(yè)生物科技有限公司的已分離、培養(yǎng)并鑒定的SD大鼠二代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞1×106，復(fù)蘇傳代后取4～6代大鼠MSCs，計(jì)數(shù)稀釋至1×105／只抽入1ml注射器備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠80只，雌性，體重185±15g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD雌性大鼠80只，隨機(jī)分為5組，每組16只。①肺水腫組：腹腔注射6%NH4Cl 0.4ml／100g；②干細(xì)胞治療組：腹腔注射氯化銨同肺水腫組，30min后尾靜脈注射干細(xì)胞1×106／只。③干細(xì)胞預(yù)防組：尾靜脈注射干細(xì)胞1×106／只，30min后腹腔注射相同劑量氯化銨。④干細(xì)胞對(duì)照組：8只腹腔注射氯化銨同肺水腫組，30min后尾靜脈注射等量生理鹽水；另8只尾靜脈注射等量生理鹽水，30min后尾腹腔注射同劑量氯化銨。⑤空白對(duì)照組：8只腹腔注射等量生理鹽水，30min后尾靜脈注射等量無(wú)血清DMEM；另8只尾靜脈注射等量無(wú)血清DMEM，30min后腹腔等量生理鹽水。

2.2 肺重系數(shù)計(jì)算（肺重系數(shù)＝肺重量g／體重g×100% ）各組動(dòng)物分別在上述處理后30min、2h、1d、7d時(shí)間點(diǎn)快速處死4只動(dòng)物，將肺及心臟一起取出，剪除心臟及脂肪組織，用濾紙吸去肺表面液體，用天平稱(chēng)兩肺重量，計(jì)算肺重系數(shù)。若肺重系數(shù)＞1%，證明肺水腫形成。

2.3 組織病理學(xué)觀察 分別對(duì)每只肺稱(chēng)重后的左肺組織用10%甲醛組織固定，石蠟包埋切片HE染色。

2.4 掃描電鏡觀察 對(duì)各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)死的動(dòng)物選取1只肺稱(chēng)重后的右肺組織，修剪成1cm×1cm大小組織片，放入3%的戊二醛固定液進(jìn)行前固定，4℃冰箱內(nèi)2h以上，0.1mol／L PBS漂洗，用500，750，1000ml／L乙月青梯度脫水，JEE－4X真空蒸發(fā)儀真空干燥，JEC－I100離子濺射儀噴金處理；HITACHIS－3400N掃描電鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異，P＞0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 肺重系數(shù) 見(jiàn)附表。肺水腫組、干細(xì)胞治療組、干細(xì)胞預(yù)防組肺重系數(shù)在注射氯化銨后的在各時(shí)間點(diǎn)（30min，2h，1d，7d）與相應(yīng)對(duì)照組進(jìn)行比較，各組在2h時(shí)間點(diǎn)的肺重系數(shù)與對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。干細(xì)胞治療組在各時(shí)間點(diǎn)（30min，2h，1d，7d）的肺重系數(shù)與肺水腫組的比較，干細(xì)胞治療組在2h時(shí)間點(diǎn)的肺重系數(shù)有顯著差異（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。干細(xì)胞預(yù)防組在各時(shí)間點(diǎn)肺重系數(shù)與肺水腫組的比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

附表 干細(xì)胞治療／預(yù)防對(duì)大鼠肺重系數(shù)的影響（ˉx±s）

2 肺組織光鏡病理學(xué)變化 見(jiàn)圖1～7。正常肺組織肺泡腔結(jié)構(gòu)正常，無(wú)滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血。肺水腫組，腹腔氯化銨注射30min時(shí)肺泡壁毛細(xì)血管輕度充血，肺泡腔出現(xiàn)少許粉紅色滲出物，2h肺泡腔大量滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管明顯充血。1d，7d時(shí)部分肺泡壁增厚，肺泡腔無(wú)明顯滲出。干細(xì)胞治療組在30min時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，2h時(shí)可見(jiàn)肺泡壁少許充血。1d，7d時(shí)肺泡壁、肺泡腔組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。干細(xì)胞預(yù)防組肺組織病理學(xué)變化各個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本與肺水腫組相同。

圖1 對(duì)照組肺泡腔結(jié)構(gòu)正常，無(wú)滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血（HE×400）

圖2 肺水腫組30min時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)基本正?；蚍闻萸怀霈F(xiàn)少許粉紅色滲出物（HE×400）

圖3 肺水腫組2h時(shí)肺泡腔大量滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管明顯充血（HE×400）

圖4 肺水腫組1d，7d時(shí)部分肺泡壁增厚，肺泡腔無(wú)明顯滲出（HE×400）

圖5 干細(xì)胞治療組在30min時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)基本正常（HE×400）

圖6 干細(xì)胞治療組2h時(shí)可見(jiàn)肺泡壁少許充血（HE×400）

3 肺組織電鏡下病理學(xué)變化 見(jiàn)圖8～11。對(duì)各組2h的肺組織進(jìn)行掃描電鏡觀察，肺水腫組肺泡腔明顯擴(kuò)大，Ⅱ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)整，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞。干細(xì)胞治療組肺泡腔擴(kuò)大，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，少許Ⅱ型細(xì)胞細(xì)胞脫落到肺泡腔。干細(xì)胞預(yù)防組肺泡腔擴(kuò)大，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，分泌顆粒有排空現(xiàn)象。對(duì)照組肺泡腔較小（正常），無(wú)紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，板層小體結(jié)構(gòu)完整。

圖7 干細(xì)胞治療組7d肺泡壁、肺泡腔組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常（HE×400）

圖8 肺水腫組在2h時(shí)肺泡腔明顯擴(kuò)大，Ⅱ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)整，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞 （×12K）

圖9 干細(xì)胞治療組在2h時(shí)，肺泡腔擴(kuò)大，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，少許Ⅱ型細(xì)胞細(xì)胞脫落到肺泡腔（×12K）

討 論

成人肺干細(xì)胞在正常狀態(tài)下增殖十分緩慢，當(dāng)肺組織受損后通常通過(guò)局部的更新加快來(lái)修復(fù)維持細(xì)胞的狀態(tài)，但增殖潛能低，修復(fù)效果十分有限。除肺自身存在的干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，分泌顆粒有排空現(xiàn)象（×12K）（MSCs）和造血干細(xì)胞，也可以進(jìn)入“歸巢”受損肺組織，轉(zhuǎn)化為肺內(nèi)細(xì)胞。Rojas等［3］將 MSCs移植到博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)輸入體內(nèi)的MSCs能定向遷移到肺損傷區(qū)域并分化為特定的肺細(xì)胞表型。MSCs移植后在肺損傷動(dòng)物模型中的抗炎效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能也得到進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，陳莉娜等［4］研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)［5］，受損的肺細(xì)胞能誘導(dǎo)MSCs的遷移，MSCs參與受損肺細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)過(guò)程。

圖10 干細(xì)胞預(yù)防組在2h時(shí)，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡腔

圖11 對(duì)照組2h時(shí)肺泡腔較?。ㄕ＃瑹o(wú)紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，板層小體結(jié)構(gòu)完整（×12K）

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論從各時(shí)間點(diǎn)肺重系數(shù)或是光鏡組織病理學(xué)觀察，6%氯化銨腹腔注射復(fù)制的大鼠肺水腫模型在2h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，肺水腫表現(xiàn)最為顯著，肺泡腔可見(jiàn)大量滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管明顯充血，在1d和7d時(shí)小部分肺組織出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)。干細(xì)胞治療組在各時(shí)間點(diǎn)肺水腫病理學(xué)表現(xiàn)較肺水腫組明顯減輕，而干細(xì)胞預(yù)防組在各時(shí)間點(diǎn)其肺組織病理學(xué)表現(xiàn)與肺水腫組相近。通過(guò)電子顯微鏡對(duì)動(dòng)物模型2h時(shí)間點(diǎn)超微結(jié)構(gòu)的觀察，肺水腫組肺泡腔明顯擴(kuò)大，Ⅱ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)整，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞。干細(xì)胞治療組可見(jiàn)肺泡腔擴(kuò)大，未見(jiàn)紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，少許Ⅱ型細(xì)胞細(xì)胞脫落到肺泡腔。干細(xì)胞預(yù)防組肺泡腔擴(kuò)大，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，分泌顆粒有排空現(xiàn)象。對(duì)照組肺泡腔較?。ㄕ＃?，無(wú)紅細(xì)胞，Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，板層小體結(jié)構(gòu)完整。

急性肺水腫是體液在肺間質(zhì)或肺泡內(nèi)積聚，大多數(shù)是由于肺毛細(xì)血管通透性增加或毛細(xì)血管內(nèi)壓升高所致，很多因素可以引起肺水腫，其發(fā)生的病理學(xué)說(shuō)頗多，其中腹腔注射氯化銨是誘發(fā)肺水腫模型是一種經(jīng)典的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肺水腫模型進(jìn)行預(yù)防性干細(xì)胞移植及治療性干細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)治療性干細(xì)胞移植能明顯減輕肺重系數(shù)及組織病理學(xué)改變，在急性期減輕，在恢復(fù)期未發(fā)現(xiàn)纖維化改變。而預(yù)防性移植組均對(duì)肺重系數(shù)及組織病理學(xué)改變急性期及恢復(fù)期無(wú)減輕，說(shuō)明干細(xì)胞能移植作為對(duì)急性肺水腫治療方法，而不能作為肺水腫防護(hù)措施。這與干細(xì)胞得到肺組織受損的“信號(hào)”后，才能迅速“集結(jié)”并“歸巢“受損肺組織，修復(fù)肺組織理論一致。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為急性肺水腫救治及防護(hù)提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。

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