急性冠脈綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR－146a表達(dá)及其與炎癥因子的相關(guān)性研究

郭 敏，閆 蕊，呂吉元，范春雨

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是在大、中動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷后細(xì)胞免疫所接到的慢性炎癥反應(yīng)［1］。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制及危險(xiǎn)因素的深入了解和積極控制，慢性心血管病的一級(jí)預(yù)防取得了令人鼓舞的進(jìn)展，然而急性心血管事件（包括心臟性猝死和急性冠狀動(dòng)脈綜合征）的預(yù)防及治療仍缺乏有效的措施。近年研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致急性心血管病事件的主要原因是AS斑塊的易損性，而炎癥在易損斑塊發(fā)生機(jī)制中的核心作用日益受到重視［2］。

MicroRNA是一組最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性的非蛋白編碼調(diào)控RNA，這些含有19個(gè)～23個(gè)核苷酸單鏈RNA可以通過與靶基因mRNA的3’UTRs不同程度的互補(bǔ)結(jié)合，以降解靶基因mRNA或抑制翻譯兩種方式調(diào)節(jié)生物體內(nèi)基因的表達(dá)［3］。晚近研究提示，MicroRNA（miR－146a）在T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞中均有表達(dá)，并與多種炎癥因子及轉(zhuǎn)錄因子的活性有密切關(guān)系，在免疫反應(yīng)中miR－146a可能發(fā)揮了精細(xì)的調(diào)控作用［4］。本研究通過對(duì)急性冠脈綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)miR－146a表達(dá)水平的檢測(cè)及其與炎癥因子相互關(guān)系的探討，為miR－146a在ACS中的基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011年7月—2012年2月在我院住院及門診隨訪的患者91例，其中急性心肌梗死（AMI）26例，不穩(wěn)定型心絞痛（UA）25例，穩(wěn)定型心絞痛（SA）22例，胸痛綜合征（CPS）18例，所有患者均行冠狀動(dòng)脈造影檢查。CPS組為胸痛但不伴有心電圖改變和冠狀動(dòng)脈狹窄及痙攣［5］。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重的肝腎功能不全；心臟或其他部位的急、慢性炎癥；合并腦卒中；惡性腫瘤；風(fēng)濕性疾??；高熱以及應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及鴉片類藥物等。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集 AMI與UA患者均在發(fā)病24h內(nèi)從前臂周圍靜脈采取空腹血標(biāo)本，SA組和CPS組于冠狀動(dòng)脈造影時(shí)采血3mL，肝素鈉抗凝。

1.2.2 Real－time PCR法檢測(cè) miR－146amRNA的表達(dá) 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用 miReasy Mini Kit試劑盒提取＜200bp RNA，每組設(shè)10μL RT反應(yīng)體系采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取5μL cDNA模板采用the miScript Primer Assay及the miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR。miR－146a擴(kuò)增應(yīng)用 miScript通用引物及其特異性引物（5′－UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU－3′the miScript Primer Assay），同時(shí)以5S作為內(nèi)參（上述試劑盒均購自QIAGEN公司，所用操作步驟均按照說明書進(jìn)行），應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Northern blot法驗(yàn)證miR－146amRNA表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞總RNA各100μg，用8M尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠分離，并用半干式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至尼龍膜，紫外交聯(lián)固定。預(yù)雜交后，加入地高辛標(biāo)記的探針，42℃雜交24h。經(jīng)洗膜、曝光與放射自顯影后觀察，所用的寡核苷酸探針為miR－146a：U6：5′－CTCGCTTCGGCAGCAGCACA－3′。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基上清炎癥因子的表達(dá) 分離的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／mL，加入植物血凝素（PHA）5ng／mL濃度，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清儲(chǔ)存于－20℃用于細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子（TNF－α）、γ干擾素（IFN－γ）、白介素－10（IL－10）檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行方差齊性檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)比較用單因素方差分析，兩個(gè)均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較（見表1） 4組患者的年齡、血脂均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組患者年齡、血脂比較（x±s）

2.2 Real－time PCR和Northern blot檢測(cè) miR－146amRNA結(jié)果（見表2）

表2 各組miR－146amRNA檢測(cè)結(jié)果（x±s） %

2.3 PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 與SA組及CPS組相比，AMI及UA組TNF－α、IFN－γ表達(dá)明顯升高（P＜0.01），IL－10則無顯著變化（P＞0.05）。SA組及CPS組間和AMI及UA組間各個(gè)細(xì)胞因子間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果（x±s）ng／mL

2.4 miR－146a與炎癥因子的相關(guān)性 miR－146a與TNF－α（r＝0.612，P＜0.01）、IFN－γ（r＝0.573，P＜0.01）呈顯著正相關(guān)，而與IL－10無顯著相關(guān)性（r＝0.166，P＞0.05）。

3 討 論

ACS是不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊發(fā)生破裂繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成、血管痙攣而引起的一系列急性和亞急性心肌缺血的臨床綜合征。臨床表現(xiàn)為不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。炎癥反應(yīng)在ACS不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展及最終破裂過程中起著至關(guān)重要的作用。因此，參與ACS不穩(wěn)定斑塊破裂的炎癥因子及其調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)防治急性冠脈綜合征至關(guān)重要。

晚近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA是一種存在于各種生物體內(nèi)的具有廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡、分化和發(fā)育的微小RNA。到目前為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種MicroRNA，它們有可能對(duì)人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調(diào)控作用［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，眾多miRNA和靶基因之間形成復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)，在免疫反應(yīng)強(qiáng)度、時(shí)效性、細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)均可發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)作用［7］。晚近研究發(fā)現(xiàn)，miR－146a在銀屑病皮損部位和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變部位的滑膜細(xì)胞。巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞中表達(dá)均增加，提示miR－146a參與了慢性炎癥的病理過程［7］。Taganov等［8］研究也發(fā)現(xiàn)在 LPS刺激后的單核細(xì)胞中miR－146a的表達(dá)增加，炎癥因子TNF－α、IL－1β也可以通過NF－κB依賴的途徑誘導(dǎo)miR－146a表達(dá)上調(diào)，從而提出miR－146a可能是免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而以往大量研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病都是Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的器官特異性自身免疫疾病，可能有類似的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)miR－146a在ACS患者中的表達(dá)較之CPS及SA患者中的表達(dá)明顯增高，提示miR－146a可能參與了ACS的斑塊炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致臨床心血管事件的發(fā)生。

TNF－α和IFN－γ是具有廣泛生物學(xué)特性的多肽調(diào)節(jié)因子，在介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)過程中起重要作用，二者在AS中大量表達(dá)，它們可以誘導(dǎo)自身表達(dá)及使其他細(xì)胞因子及黏附分子表達(dá)增加；損傷內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管平滑肌增殖和收縮，促進(jìn)AS斑塊形成和斑塊損傷處血管痙攣收縮；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡等，從而促進(jìn)了斑塊的破裂，導(dǎo)致了ACS的發(fā)生。IL－10被認(rèn)為是一種免疫抑制因子，可抑制單核巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞合成炎癥因子，減慢AS進(jìn)程，也有研究證明IL－10在外周血中有抑制組織因子的作用，從而在AS進(jìn)程中發(fā)揮抗炎、抗栓作用，起到穩(wěn)定斑塊，防治ACS發(fā)生的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在ACS患者PBMC培養(yǎng)上清中促炎因子TNF－α和IFN－γ明顯增高，抗炎因子IL－10變化不明顯，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR－146a的表達(dá)與TNF－α和IFN－γ呈明顯正相關(guān)，提示miR－146a可能是通過促進(jìn)致炎因子的表達(dá)，促進(jìn)ACS的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR－146a可能在ACS的免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極的作用，從而可以成為ACS基因治療的新靶點(diǎn)，將在下一步的研究中通過體外干預(yù)miR－146a表達(dá)，進(jìn)一步探討其在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為ACS的臨床防治提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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