銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨對干旱脅迫反應的比 較 研 究*

馬存旺

(楚雄市紫溪鎮(zhèn)前進中學，云南 楚雄 675000)

前言

水分是制約植物生長的主要環(huán)境因子，特別是在滇中地區(qū)，水資源數(shù)量有限，時空分布極不均勻，從而極大地增加了觀賞蕨類植物引種馴化、園林綠化和管理的難度。目前普遍認為，植物在逆境下如干旱會引起膜傷害和膜透性的增加及生物自由基的累積，而植物體內一系列的抗氧化酶類和小分子物質以清除這些活性氧自由基，即為植物對不良環(huán)境作出的適應性反應［1，2］。已經(jīng)在很多植物中發(fā)現(xiàn)，水分虧缺時，因自由基產(chǎn)生過多，或由于抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱，體內自由基不能被完全清除而造成自由基的累積，進而會危害植物［3］。

國內外學者對作物的抗旱 (節(jié)水)性及其鑒定指標進行了大量的研究［4～7］澳大利亞在作物蒸騰、水分利用率和收獲指數(shù)等方面的研究取得了較大進展，但對蕨類植物的抗旱性報道及其少見。因此，本試驗旨在研究自然干旱脅迫條件下銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨的生理生化指標變化，進而比較其抗旱性差異，為其引種栽培提供理論依據(jù);深入了解植物抗旱特性，探討植物可能的抗旱機理，為蕨類植物的抗旱生理研究打下堅實的基礎。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

材料采自楚雄師范學院溫室，經(jīng)徐成東教授鑒定，采后種于花盆成活穩(wěn)定后備用。其中，銀脈鳳尾蕨銀脈鳳尾蕨Pteris ensiformis Burm.f.var.victoriae Hort為觀賞栽培種，闊葉鱗蓋蕨Microlepia platyphylla(D.Don)J.Sm.為野生引種栽培。

1.2 試驗儀器、器材及試劑

儀器:722s型分光光度計，HH－S2s型恒溫水浴鍋，電子天平，離心機，烘箱，酸式滴定管等。

試劑:冰醋酸，茚三酮，磷酸，磺基水楊酸，甲苯，標準脯氨酸，丙酮，濃鹽酸，髙錳酸鉀，草酸，雙氧水，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，碳酸鈣，蒸餾水。

1.3 實驗材料處理方法

將實驗材料種植于相同條件下同樣大小的花盆中，分別各種5盆，在相同條件下培育生長，待長勢穩(wěn)定后才能對其進行相應的處理。每隔3天取材一次測定指標并且記錄數(shù)據(jù)，一般共測五次。

1.4 生理指標測定方法

1.4.1 脯氨酸標準曲線的制作

標準溶液的配制:(1)標準液的配制 準確稱取25mg恒重的脯氨酸于250ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為100ug/ml的脯氨酸標準溶液。

(2)系列脯氨酸濃度的配制 用移液管分別吸取上述配制的脯氨酸標準溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml于6個50ml容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。得濃度分別為1、2、3、4、5、6μg/ml的脯氨酸標準溶液。

標準曲線繪制:(1)取2.0ml不同濃度的脯氨酸標準溶液于6支試管中，加2ml冰乙酸和2ml酸性茚三酮液，于沸水浴中加熱30min。

(2)取出冷卻后向各管加入4ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層，以甲苯液為對照，在波長520nm下比色測定。

(3)葡萄糖標準溶液的濃度與吸光度如表1，以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1。其線性回歸方程為y=0.05934x+0.01147(R=0.99771)。

圖1 脯氨酸標準曲線Fig 1 Standard curve of proline

表1 脯氨酸標準溶液的濃度與吸光度Table 1 Concentration and absorbance of proline standard solution

1.4.2 葉片含水量測定(RWC)

采用自然含水量法［8］測定葉片含水量。(1)稱量瓶的恒重:將洗凈的兩個稱量瓶編號，放在105℃恒溫烘箱中，烘2h左右，用坩堝鉗取出放入干燥器中冷卻至室溫后，在電子天平上稱重，再于烘箱中烘2h，同樣于干燥器中冷卻稱重，如此重復2次 (2次稱重的誤差不得超過0.002g)，求得平均值m1，將稱量瓶放入干燥器中待用。

(2)將待測植物葉片從植株上取下后迅速剪成小塊，裝入已知的稱量瓶中蓋好，在分析天平上準確稱取質量，得瓶與鮮樣品總質量m2，然后于105℃烘箱中干燥4～6h(注意要打開稱量瓶蓋子)。取出稱量瓶，待其溫度降至60～70℃后用坩堝鉗將稱量瓶蓋子蓋上，放在干燥器中冷卻至室溫，再用電子天平稱重，然后再放到烘箱中烘2h，在干燥器中冷卻至室溫，再稱重。這樣重復幾次，直至恒重為止。稱得質量是瓶與干樣品總質量m3。烘時注意防止植物材料焦化。如系幼嫩組織，可先用100～105℃殺死組織后，再在80℃下烘至恒重。

(3)記錄及計算

編號 稱量瓶重 (m1)瓶重 +樣品鮮重 (m2)瓶重 +樣品干重 (m3)

樣品鮮重mf=m2－m1

樣品干重md=m3－m1

表2 葉片含水量百分比Table 2 Percentage of leaf water contents

1.4.3 游離脯氨酸 (Pro)含量測定

采用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸 (Pro)含量［9］。(1)脯氨酸提取 取不同處理的剪碎混勻葉片0.5g，分別置于大試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。

(2)取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和2ml酸性茚三酮液，于沸水浴中加熱30min。

(3)取出冷卻后向各管加入4ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層，以甲苯液為對照，在波長520nm下比色測定。

(4)結果計算:從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度，按下式計算樣品中脯氨酸含量:

式中 C——提取液中脯氨酸含量 (μg)，由標準曲線求得;

V——提取液總體積 (ml);

a——測定時所吸取提取液的體積 (ml);

W——樣品重 (g)。

由公式計算結果單位為:ug/g

表3 脯氨酸含量Table 3 contents of proline

1.4.4 葉綠素 (Chl)含量的測定［9］

(1)色素的提取 取新鮮葉片，剪去粗大的葉脈并剪成碎塊，稱其0.5g放入研缽中加純丙酮5ml，研磨成勻漿，再加80%丙酮5ml，將勻漿轉入離心管，離心后棄沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ml。

(2)測定光密度 取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀釋后轉入比色杯中，以80%丙酮為對照，分別測定663nm、645nm處的光密度值。

(3)結果計算 由公式Ca+b(mg/l)=8.02OD663+20.21OD645計算出濃度，再計算出鮮葉片含量 (mg/g)。

表4 葉綠素含量的變化Table 4 changes of chlorophyll contents

1.4.5 過氧化氫酶 (CA T)活性測定

過氧化氫酶 (CA T)活性采用高錳酸鉀滴定法測定［9］。(1)酶液提取取材料葉片1g，加入PH 7.8的磷酸緩沖液少許，研磨成勻漿，轉入容量瓶中定容為25ml，將其4000r/min離心15分鐘，上清液即為過氧化氫酶粗提液。

(2)取50ml三角瓶4個 (兩個測定，兩個對照)，測定瓶各加入酶液2.5ml，對照瓶各加入煮沸后變性酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/l的過氧化氫，同時記時，于30度恒溫水浴中保溫10 min，立即加入10%硫酸2.5ml。

(3)用0.1mol/l高忙酸鉀液滴定，至出現(xiàn)粉紅色30min內不消失為終點。

表5 過氧化氫酶活性的變化Table 5 Changes of catalase activity

2.結果與分析

2.1 葉片含水量 (RWC)

從總體上看，隨著時間的增加自然干旱脅迫加重，兩種蕨葉片的含水量均有所下降，但銀脈鳳尾蕨降低幅度較小，具體變化情況如圖2。

圖2 葉片含水量百分比Fit 2 Percentage of leaf water content

2.2 葉綠素含量 (CHL)

銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨葉片中葉綠素含量隨干旱脅迫程度的增加均呈降低的趨勢，但是銀脈鳳尾蕨較闊葉鱗蓋蕨含量降低得更慢，體變化情況如圖3。

圖3 葉綠素含量的變化 (單位:毫克每毫升)Fig 3 changes of chlorophyll contents(unit:mg/g)

2.3 過氧化氫酶活性 (CAT)

從圖4可以看出:兩種蕨隨著干旱脅迫的加重過氧化氫酶活性都先上升在降低，但是銀脈鳳尾蕨過氧化氫酶活性較闊葉鱗蓋蕨變化得更緩慢。

圖4 過氧化氫酶活性的變化單位:mg/(g.min)Fit4 Changes of catalase activity(unit:mg/g.min)

2.4 脯氨酸含量 (pro)

從圖5可以看出:兩種蕨隨著干旱脅迫的加重脯氨酸含量都在升高，但銀脈鳳尾蕨較闊葉鱗蓋蕨含量更高。采用磺基水楊酸提取植物體內的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài) (干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內與其光密度成正比。

圖5 脯氨酸含量 (單位:ug/g)Fig 5 Contents of proline(單unit:ug/g)

3 結論與討論

由于葉片相對含水量能反映細胞的水分生理狀態(tài)，缺水條件下細胞內水分減少，相對含水量下降［10—11］，并且總體變化趨勢銀脈鳳尾蕨較闊葉鱗蓋蕨小，穩(wěn)定性較好，受水分影響較小，所以銀脈鳳尾蕨較闊葉鱗蓋蕨更耐旱。

對葉綠素研究發(fā)現(xiàn)，銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨葉片中葉綠素含量隨干旱脅迫程度的增加均呈降低的趨勢，但是各品種的下降幅度不一樣，銀脈鳳尾蕨下降趨勢緩慢，最小值較闊葉鱗蓋蕨小，再根據(jù)葉片葉綠素含量的高低，可直接反應植物對干旱脅迫的抵抗能力，通過測定葉綠素含量的變化可以確定植物抗旱性的強弱［12］，便可得知銀脈鳳尾蕨抗旱性強于闊葉鱗蓋蕨。

過氧化氫酶活性變化銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨二者都是先升后隆的變化趨勢，但闊葉鱗蓋蕨過氧化氫酶活性上升得較快且峰值較大，下降時速度較快峰值較小，受干旱影響變化較大，表現(xiàn)出不穩(wěn)定狀況，并且其在植物體內的作用是過氧化氫酶與超氧化物岐化酶、過氧化物酶協(xié)同作用防御活性氧或其它過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害，從而提高植物抗性［13］。所以也不難得出闊葉鱗蓋蕨抗旱性較弱這一結論。

脯氨酸作為滲透調節(jié)物質之一，能夠與細胞內的一些化合物形成類似親水膠體的聚合物，具有一定的保水作用，在逆境下植物體內脯氨酸的含量顯著增加，植物體內脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性強的品種常常積累較多的脯氨酸。受干旱條件的刺激，細胞內主動積累脯氨酸等滲透調節(jié)物質，促使植物加強水分吸收，維持細胞一定的膨壓，從而保持細胞生長、氣孔開放以及光合作用等生理活動的正常進行［13］。因此，從實驗不難看出，銀脈鳳尾蕨抗旱性較闊葉鱗蓋蕨強。

另外，本次實驗僅研究了銀脈鳳尾蕨和闊葉鱗蓋蕨干旱脅迫下的生理反應，對其形態(tài)特征、解剖結構等方面未作深入研究，有待進一步進行更深入的研究。

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