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    擬南芥類鋅指基因AT3G02790/AT5G16470純合雙突變的篩選及其表型分析1)

    2012-07-02 00:08:42鄭唐春施曉文
    關(guān)鍵詞:鋅指甘露醇突變體

    鄭唐春 施曉文

    (林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱,150040)(吉林省林業(yè)勘察設(shè)計研究院)

    臧麗娜 朱銀鳳 王亞軍 曲冠證

    (林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

    鋅指基因是一類廣泛研究的抗逆相關(guān)基因,廣泛分布在動物、植物和微生物中[1]。鋅指蛋白的共同特征是蛋白質(zhì)通過與Zn2+的結(jié)合,使自身折疊成指狀的多肽結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白通過與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特異性結(jié)合,以及與自身或其它鋅指蛋白的結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)水平[2-3]。目前,利用反向遺傳學(xué)的方法探索基因的表達(dá)規(guī)律,研究基因功能的報道越來越多。擬南芥AT3G02790和AT5G16470基因被歸屬為鋅指基因家族,CLUSTALW程序分析結(jié)果表明,其核酸序列相似性達(dá)到81%,這兩個同源基因可能參與擬南芥植株的生長過程。本文以擬南芥AT3G02790和AT5G16470純合單突變株為親本(均為T-DNA插入突變體),采用人工雜交技術(shù)獲得雜合子后,根據(jù)基因分離定律,結(jié)合PCR檢測技術(shù),經(jīng)多輪PCR檢測后獲得純合雙突變株。并初步分析了純合雙突變株的表型,為下一步反向遺傳學(xué)探究該類鋅指基因功能提供試驗材料,同時也表明用雜交技術(shù)獲得擬南芥多基因突變體是可行的。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    材料為從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Centre,ABRC)購買的編號為CS-851718和SALK-091992擬南芥種子。通過篩選與擴繁獲得AT3G02790和AT5G16470純合單突變的種子(原種為Columbia-0型)。rTaq酶、DNA marker、SYBR Premix EX TaqⅡ等PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司(中國大連),EasyPure Plant RNA Kit購自全式金公司,其它試驗試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

    1.2 擬南芥純合單突變的驗證

    種子置于濕潤濾紙上4℃春化處理3~4 d。用蘸濕的竹簽沾取單粒種子點播于經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)(V(營養(yǎng)土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1)中,每株擬南芥約占3 cm×3 cm空間即可。放入生長室(22~23℃)中,相對濕度60% ~80%,每天16 h光照/8 h黑暗,光強約150 μmol/(m2·s)。3~4 d即可出芽。

    半個月后擬南芥蓮座葉富集,摘取幾株突變株的蓮座葉用CTAB法[4]提取擬南芥總 DNA。以兩對引物:pBI121-Kan-F/pBI121-Kan-R;pDs-Lox-Hyg-F/pDs-Lox-Hyg-R(表 1)對單突變分別進(jìn)行驗證。PCR反應(yīng)體系:擬南芥基因組DNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer-F(10 μmol/L)2 μL;Primer-R(10 μmol/L)2 μL;rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,加 ddH2O 至終體積25 μL。反應(yīng)程序94 ℃ 4 min,94 ℃ 30 s,55 ℃30 s,72℃ 1 min,共35個循環(huán);72℃ 7 min延伸。PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

    1.3 擬南芥純合雙突變體的篩選

    1.3.1 擬南芥的人工雜交

    選取檢測過純合單突變的植株,待親本植株開花后,用鑷子將多余的花蕾移除,一般只保留最佳的花蕾5~6個。將花蕾(雜交母本)固定在解剖鏡視野的正中央,用解剖紙輕輕壓住花蕾,用鑷子除去母本的未開花的全部萼片、花瓣和雄蕊。第二天上午10:00左右從雜交父本上用鑷子摘取花藥,涂抹在柱頭上,授以父本的花粉,做好標(biāo)記。通常柱頭授粉10 h后柱頭毛開始萎蔫。3 d后種莢即伸長,據(jù)此判定雜交成功與否。雜交成功后,將母本植株的其它花蕾除去,雜交的種莢變黃時,收獲F1代種子。

    1.3.2 擬南芥雜合體植株的驗證

    種植收獲的F1代種子,用CTAB法提取擬南芥總DNA,根據(jù)1.2中驗證單突變的引物及其反應(yīng)體系的方法來驗證F1代的基因型。對AT3G02790基因驗證的PCR稱為PCR1,對AT5G16470基因驗證的PCR稱為PCR2,如果兩輪PCR都能獲得目的條帶,則收獲驗證后的雜合子植株的F2代種子。

    1.3.3 擬南芥純合雙突變植株的篩選

    種植收獲的F2代種子,隨機選擇120株雜合子栽種,用CTAB法提取擬南芥總DNA。用兩對引物:T-3-F/T-3-R;T-5-F/T-5-R(表 1)對雜合子分別進(jìn)行驗證。對獲得的雜合子植株,先驗證AT3G02790基因純合體的PCR稱為PCR3;對篩選出來的含AT3G02790基因純合體的植株再驗證AT5G16470基因純合體的PCR稱為PCR4。PCR反應(yīng)體系:擬南芥基因組 DNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer-F(10 μmol/L)2 μL;Primer-R(10 μmol/L)2 μL;rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,加 ddH2O 至終體積 25 μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性 4 min;94℃變性 30 s,52℃(AT3G02790)或46℃(AT5G16470)退火30 s,72 ℃延伸1 min,重復(fù)35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

    1.4 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因不同脅迫下的表達(dá)水平檢測

    野生型擬南芥栽種45 d后,分別進(jìn)行如下處理:去離子水(Distilled Water),300 mmol/L甘露醇,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L H2O2,100 μmol/L ABA(abscisic acid)溶液進(jìn)行澆灌處理及低溫(4℃)處理,分別處理 0、1、3、6、12、24 h 后,取適量擬南芥葉片用液氮冷凍處理并于-80℃下存放。用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取植株的總RNA,檢測純度和濃度后,以0.5 μg總RNA為起始材料,采用PrimeScript TM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍,用于定量RT-PCR反應(yīng)模板。用兩對引物AT3G-F/AT3G-R、AT5G-F/AT5G-R進(jìn)行實時熒光定量RTPCR檢驗。反應(yīng)體系為:10 μL 2×SYBR premix Ex Taq、引物 Primer-F(10 μmol/L)、Primer-R(10 μmol/L)各1 μL和2 μL稀釋的各樣品的模板,加去離子水補足20 μL。PCR反應(yīng)在OPTIONⅡ熒光定量PCR儀上完成。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性12 s;57℃退火30 s;72℃延伸30 s;78.5℃讀板1 s,45次循環(huán)。用Actin基因(AT3G46520)作為內(nèi)參,內(nèi)參引物:Actin-F/Actin-R(表1)。用2-△△Ct方法進(jìn)行基因的相對定量分析[5]。

    表1 PCR反應(yīng)引物匯總

    1.5 擬南芥純合雙突變株的脅迫試驗

    將篩選出來的雙突變株收獲種子后,以野生型種子為對照。消毒后點種到不作處理的1/2MS、含有150 mmol/L NaCl或300 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上,觀察種子的萌發(fā)情況和幼苗長勢。5 d后,再將未脅迫處理的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS、含有150 mmol/L NaCl或300 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上,觀察突變株與野生型的表型差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因序列分析

    利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中的 blastp程序發(fā)現(xiàn)AT3G02790基因和AT5G16470基因具有高度的相似性,一致性為81%(圖1,A)。在擬南芥中,這兩個基因被劃為C2H2型鋅指基因。但通過對Ex-PASy進(jìn)行Pfam表明,這兩個基因都不具備鋅指蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域,這說明AT3G02790基因和AT5G16470基因并不屬于鋅指類基因,而是一種功能未知的基因。

    通過PCR檢測獲得純合雙突變株,根據(jù)Tair(The Arabidopsis Information Resource)網(wǎng)站推斷的TDNA插入位置,結(jié)合RT-PCR檢測,得知T-DNA插入位置均在啟動子區(qū)域(圖1,B)。純合突變體植株中AT3G02790/AT5G16470基因的表達(dá)水平顯著降低(圖1,C)。

    圖1 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因序列分析

    2.1.1 擬南芥單突變植株的驗證

    將購買的編號為CS-851718和SALK-091992的擬南芥種子種植后提取總DNA,驗證是否為突變株,為下一步人工雜交選取父本、母本。因為CS-851718突變株的 T-DNA插入質(zhì)粒是 pDs-Lox,含有潮霉素抗性基因,SALK-091992突變株的 TDNA插入質(zhì)粒是proKII,含有卡那抗性基因,所以設(shè)計引物(表1)能擴增出潮霉素基因(792 bp)(圖2,A)和卡那霉素基因(593 bp)(圖2,B)。

    2.1.2 擬南芥雜合突變體的篩選

    因為AT3G02790/AT5G16470單突變體為純合體,所以雜交后獲得的是兩個基因的雜合突變株。將獲得的F1代雜交種子種植后,提取單株擬南芥總DNA,用方法1.2中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來檢驗雜合突變株。經(jīng)擴增檢驗,PCR1和PCR2分別能擴增出長度為792 bp和593 bp的條帶,說明隨機選取的3株F1代植株全部為雜合體(圖3)。

    圖2 擬南芥單突變株的PCR鑒定

    圖3 F1代雜合子的篩選

    2.1.3 擬南芥純合雙突變的篩選

    根據(jù)T-DNA片段的兩端序列設(shè)計引物,擴增檢驗純合突變株。如果基因未被突變掉或者為雜合體的時候,能夠擴增出目的條帶。如果為純合突變株,因為該基因序列編碼區(qū)外源大片段的插入會阻抑目的基因特異擴增產(chǎn)物的形成,最終導(dǎo)致無法擴增出目的條帶。本試驗采用的PCR是在確定一個基因(AT3G02790)為純合突變體的基礎(chǔ)上再確定另一個基因(AT5G16470)為純合突變體。AT3G02790基因兩端長度為1000 bp,AT5G16470基因兩端的長度為500 bp。經(jīng)過PCR3反應(yīng)(圖4),120株F2代中 16、17、19、20、21、27、30、32、36、39、40、42、43、44、46、47、52、53、55、57、58、60、61、67、69、70、71、72、78、79、80、84、86、87、90、92、93、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、114號未擴增出條帶,或者條帶很淡,而野生型能檢測出亮帶,說明上述各株可能為AT3G02790基因純合突變株。然后用PCR4反應(yīng)驗證(圖5),純合單突變中的 27、30、43、70、78、93、94、99、101、103、105、106、107、114號仍未檢測出目的條帶,說明上述的幾株可能是純合雙突變株。

    圖4 F2代純合單突變株(AT3G02790)的篩選

    圖5 F2代純合雙突變株的篩選

    2.2 擬南芥純合雙突變的表型觀察

    純合雙突變體不同發(fā)育時期生長狀況的結(jié)果顯示,與野生型相比,在植物的生長發(fā)育過程中沒有明顯變化(圖 6),說明在正常生長條件下,AT3G02790/AT5G16470基因的表達(dá)與表型無相關(guān)性。

    2.3 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因不同脅迫下的表達(dá)水平檢測

    用去離子水、甘露醇、NaCl、H2O2、ABA、低溫(4℃)分別處理擬南芥野生型植株,利用熒光定量PCR檢測AT3G02790和AT5G16470兩個基因的表達(dá)水平(表2、表3)。結(jié)果顯示,去離子水處理也能誘導(dǎo)兩個基因的表達(dá)。其中,H2O2能顯著誘導(dǎo)表達(dá),并于24 h達(dá)到最高,說明其受氧化脅迫誘導(dǎo)。ABA同樣能顯著誘導(dǎo)AT3G02790和AT5G16470表達(dá),于3 h達(dá)到最高,并隨處理時間的延長而逐漸降低。結(jié)果還表明,冷脅迫能顯著誘導(dǎo)AT5G16470基因表達(dá),并在6 h達(dá)到較高。而甘露醇、NaCl也能在一定程度上促進(jìn)AT3G02790/AT5G16470的表達(dá),并隨處理時間日的延長而逐漸升高。

    圖6 擬南芥純合雙突變株的表型分析

    表2 擬南芥AT3G02790基因在不同脅迫下的表達(dá)水平

    表3 擬南芥AT5G16470基因在不同脅迫下的表達(dá)水平

    2.4 擬南芥純合突變株的脅迫試驗

    純合突變株在150 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇培養(yǎng)基上發(fā)芽率比野生型稍低(表4),但在萌發(fā)時間和長勢情況上未有顯著區(qū)別(圖7)。觀察幼苗在含NaCl、甘露醇培養(yǎng)基上側(cè)根的生長狀態(tài),只有30#突變株在甘露醇脅迫下根伸長緩慢,但側(cè)根數(shù)量增加(圖7,I)。

    表4 擬南芥純合雙突變株鹽、甘露醇脅迫的發(fā)芽率 %

    圖7 擬南芥純合突變株的脅迫試驗結(jié)果

    3 結(jié)論與討論

    擬南芥鋅指基因AT3G02790和AT5G16470分別位于(2n=10)第 3條(http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=35782&type=locus)和第 5 條(http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=134268&type=locus)染色體上。AT3G02790和AT5G16470基因在F1自交產(chǎn)生F2的過程中,符合孟德爾的獨立分離規(guī)律,即在減數(shù)分裂形成配子時,位于同源染色體上的每一對等位基因都發(fā)生分離,而位于非同源染色體上的非等位基因可以自由組合。F2代群體中共有9種基因型,在F1所產(chǎn)生的16種雌雄配子可能的組合方式中,僅有1種組合的基因型是純合子,因此,在F2群體中篩選出純合雙突變體的概率為1/16。為獲得純合的雙突變體,需要對F2代大量植株提取DNA進(jìn)行PCR檢驗,但由于在F2代群體中篩選純合的雙突變體需要做較多的PCR反應(yīng)體系,因此,在確定一個基因是純合突變的基礎(chǔ)上,需要再驗證另一個基因是否為純合突變,這樣不僅能夠及時排除非目的植株,而且還可以節(jié)省PCR試劑??紤]到PCR方法自身的誤差,以及防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果,每次PCR反應(yīng)都用野生型做陰性對照[6-8]。雖然經(jīng)過自由組合后純合子出現(xiàn)的概率比較小,但擬南芥結(jié)種量很大,只要得到一株純合子,就可通過擴繁得到足夠的種子。

    通過人工雜交的方法獲得了鋅指基因AT3G02790/AT5G16470純合突變株,說明該方法對于獲得多基因植株是切實可行。對大量植株進(jìn)行篩選,經(jīng)過多輪PCR獲得了十幾個可能的純合突變株,結(jié)合RT-PCR檢測技術(shù),發(fā)現(xiàn)兩個基因均能微弱地表達(dá)。究其原因可能是因為這兩個基因的基因序列較短,只有300 bp左右,T-DNA片段未插入到基因的讀碼框中,而是插入到基因的上游啟動子序列內(nèi)(圖1B)。因為上游啟動子區(qū)域的外源片段插入,在對突變株的DNA進(jìn)行PCR檢測時,延伸合成受阻,故而擴增不出條帶;而RT-PCR是對轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測,啟動子區(qū)域受阻后,基因表達(dá)受阻礙,檢測出突變體表達(dá)水平顯著降低。

    初步研究表明,AT3G02790和AT5G16470基因受甘露醇、NaCl、H2O2、ABA、低溫(4 ℃)處理誘導(dǎo)表達(dá),可能這兩個基因也參與一些特定的脅迫應(yīng)答。AT3G02790和AT5G16470基因熒光定量PCR結(jié)果和鋅指基因的研究結(jié)果有些相似。例如:胡椒鋅指基因CaAbsi1參與對氧化物、過氧化氫和脫落酸等產(chǎn)生脅迫應(yīng)答反應(yīng)[9];菊花鋅指蛋白基因DgZFP在種子中可被NaCl、干旱、低溫(4℃)處理誘導(dǎo),Dg-ZFP基因的過量表達(dá)還能增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[10];擬南芥鋅指基因 AZF1、AZF2、AZF3 在干旱、高鹽、低溫(4℃)和外源ABA的處理后,表達(dá)量顯著增高[11]。雖然AT3G02790和AT5G16470純合突變體的表型結(jié)果顯示與野生型沒有差異,且甘露醇、NaCl脅迫試驗結(jié)果不顯著,但并不能說明AT3G02790、AT5G16470基因與鋅指蛋白基因家族間沒有相互作用。CLUSTALW程序分析顯示,AT3G02790、AT5G16470基因與鋅指基因同源性高達(dá)81%,AT3G02790和AT5G16470基因在擬南芥中暫時被定義為鋅指基因。因為 AT3G02790和AT5G16470基因并沒有鋅指基因所特有的保守區(qū)域,故而推斷這兩個基因可能是功能未知的基因。AT3G02790/AT5G16470純合雙突變株的獲得,為研究這兩個基因的未知功能與相互作用提供了良好的試驗思路,同時為下一步研究其同源基因過量表達(dá)分析奠定了材料基礎(chǔ)。

    [1]田路明,黃叢林,張秀海,等.逆境相關(guān)植物鋅指蛋白的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2005(6):12-16.

    [2]Takatsuji H.Zinc-finger transcription factors in plants[J].Cellular and Molecular Life Sciences,1998,54(6):582-596.

    [3]Murata T,Hikita K,Kaneda N.Transcriptional activation function of zinc finger protein TIS11 and its negative regulation by phorbol ester[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,274(2):526-532.

    [4]Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin,1987,19(1):11-15.

    [5]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

    [6]吳曉丹,張立軍,白雪梅,等.雜交方法獲得的擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因SUC3/SUC5雙突變體及其PCR鑒定[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6):1073-1076.

    [7]吳曉梅,陳明訓(xùn).人工雜交法獲得擬南芥酯酶基因位點AT1G54790/AT2G429雙突變體及其PCR鑒定與表型分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,46(6):1285-1288.

    [8]李敏,楊雙,阮燕曄,等.擬南芥T-DNA插入突變體atsuc3的PCR 鑒定[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(2):91-94.

    [9]Seong E S,Wang M H.A novel CaAbsi1 gene induced by earlyabiotic stresses in pepper[J].Biochemistry and Molecular Biology Reports,2008,41(1):86-91.

    [10]Liu Qinglin,Xu Kedong,Ma Nan,et al.Isolation and functional characterization of DgZFP:a gene encoding a Cys2/His2-type zinc finger protein in chrysanthemum[J].Molecular Biology Reports,2010,37(2):1137-1142.

    [11]Sakamoto H,Maruyama K,Sakuma Y,et al.Arabidopsis Cys2/His2-type zinc-finger proteins function as transcription repressors under drought,cold,and high-salinity stress conditions[J].Plant Physiology,2004,136(1):2734-2746.

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