生存素反義寡核苷酸對人胃癌細(xì)胞移植瘤作用及原理探討

王超群 孔慶兗

生存素（Survivin）是細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白家族成員，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，生存素在胃癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，應(yīng)用反義策略阻斷生存素表達(dá)在體外可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長[1]。本文研究探討生存素反義寡核苷酸對人胃癌裸鼠移植瘤的作用，并探討其與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT-3的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 人胃癌細(xì)胞系HS2746T（武漢大學(xué)培養(yǎng)物保存中心）；兔抗人STAT-3單克隆抗體（美國CST公司）；兔抗人Survivin多克隆抗體（福州邁新公司）；PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。生存素正、反義寡核苷酸由上海博亞生物工程有限公司合成與純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/C nu/nu裸小鼠30只，雌雄各半，4～6周齡，體重20～22g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 人胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)與裸鼠胃癌模型的建立[2]將 人胃癌細(xì)胞系HS2746T置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞HS2746T，稀釋為濃度為315×105/mL的細(xì)胞懸液，取0.2mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠的背部左后肢處，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過0.5cm作為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，接種后觀察注射點(diǎn)無破潰紅腫，2周左右成瘤，成瘤率為100%。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將30只成瘤裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，即空白對照組、SODN對照組和100、200、400nmol/L 3種濃度的ASODN組。各組于接種后15d開始第一次注射，并于第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d體內(nèi)多點(diǎn)注射相應(yīng)試劑0.2mL。

每次注射前用游標(biāo)卡尺測量移植瘤體積，并記錄裸鼠體重。20d后斷頸處死裸鼠，取腫瘤稱重并計(jì)算抑瘤率和腫瘤縮小率。腫瘤體積計(jì)算公式為：V(mm3)=[π×瘤體最長徑(a)×最短徑(b)2]/6；抑瘤率計(jì)算公式為：（對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%；腫瘤縮小率計(jì)算公式為：（注射前體積-注射后體積）/治療前體積×100%。

1.5 免疫組化二步法檢測STAT-3蛋白的表達(dá) 取所有裸鼠皮下移植瘤，經(jīng)10%福爾馬林固定后常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，免疫組化二步法操作步驟參照PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒的產(chǎn)品說明書進(jìn)行，并以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存素反義寡核苷酸對人胃癌細(xì)胞移植瘤的作用 所有裸鼠在接種人胃癌細(xì)胞懸液后均存活并形成腫瘤，接種點(diǎn)無破潰紅腫，成瘤時間為（13.0±2）d，接種15d后移植瘤為（72.1±8.5）mm3，比較各組平均數(shù)，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。在第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d，空白對照組及SODN對照組在腫瘤體積、抑瘤率及腫瘤縮小率等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。100、200、400nmol/L 3種濃度的ASODN組在第一次注射后4d～8d，腫瘤體積明顯小于空白對照組及SODN對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤縮小率明顯高于空白對照組及SODN對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。比較3個不同濃度的ASODN組發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度和時間的增加，裸鼠移植瘤的體積減小而腫瘤縮小率增大，呈時間和劑量依賴性。裸鼠處死后測定抑瘤率，3個不同濃度的ASODN組明顯大于空白對照組及SODN對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且400nmol/L ASODN組的抑瘤率最大達(dá)到84%。不同處理組對人胃癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用見表1。

2.2 生存素反義寡核苷酸與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT-3的關(guān)系

空白對照組及SODN對照組移植瘤中的STAT-3蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對照組比較，第一次注射后4～8d，3個不同濃度的ASODN組移植瘤中的STAT-3蛋白表達(dá)水平明顯提高（P＜0.05），且呈濃度和時間依賴性。

表1 不同處理組對人胃癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用

3 討論

生存素在機(jī)體細(xì)胞中的表達(dá)具有非常嚴(yán)格的細(xì)胞周期性，尤其在G2/M期可以特異性的表達(dá)，此外生存素的表達(dá)具有高度特異性，可以在大多數(shù)腫瘤組織和胚胎發(fā)育組織中表達(dá)，但是在正常人的終末分化組織中是不表達(dá)的。應(yīng)用反義策略阻斷生存素表達(dá)抑制癌細(xì)胞的生長是治療癌癥的新思路。

生存素與胃癌的形成和發(fā)展關(guān)系密切，是早期發(fā)現(xiàn)胃癌的良好標(biāo)志物，也是判斷預(yù)后的較佳指標(biāo)。本研究成功建立了人胃癌細(xì)胞皮下移植瘤模型，研究結(jié)果表明，空白對照組及SODN對照組對皮下移植瘤無明顯抑制作用，而3個不同濃度的ASODN組對皮下移植瘤均具有一定的抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，提示生成素ASODN能夠有效抑制移植瘤的生長。這與國外報(bào)道的生存素具有抑制腫瘤生長的報(bào)道是一致的，此外，本研究還探討了生成素ASODN與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT-3的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著生成素ASODN濃度的增加，移植瘤中的STAT-3蛋白表達(dá)水平明顯提高，呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，生成素可能是STAT-3信號通路的一個下游靶基因[3]。通過注射生成素ASODN降低了生成素表達(dá)，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而增加轉(zhuǎn)錄激活因子STAT-3的表達(dá)。

[1]付廣,王國斌,盧曉明,等.生存素反義寡核苷酸對胃癌細(xì)胞的抑制作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005,22(9)：1084-1086.

[2]付廣,王國斌,盧曉明,等.脂質(zhì)體生存素反義寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生長的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2004,42(22)：1367-1371.

[3]張建國,趙晶,李遠(yuǎn)航,等.STAT3、p-STAT3與Survivin在胃癌及其癌前病變組織中的表達(dá)及意義[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,38(12)：907-912.