維吾爾族婦女子宮頸癌和CIN中miRNA－101的表達及其與HPV的關(guān)系＊

葉 靜，林 晨，贠江力，古力娜爾·庫爾班

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊830011）

子宮頸癌一直是新疆地區(qū)發(fā)病率居首位的婦女惡性腫瘤，尤其維吾爾族婦女子宮頸癌的收治比例明顯高于其他民族，且發(fā)病年齡早，平均年齡為45.04歲（漢族為50.85歲）［1］，晚期患者較多。因此，尋找有助于子宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物是近年來子宮頸癌研究的熱點之一。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小RNA分子，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為篩查腫瘤的早期診斷指標(biāo)之一［2］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilomavirus，HPV）是目前公認(rèn)的子宮頸癌發(fā)生的高危因素之一［3］。而關(guān)于HPV與miRNA之間是否具有相關(guān)性說法不一。因此，本研究應(yīng)用鎖定核苷酸原位分子雜交（LNA－ISH）技術(shù)檢測新疆維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ～Ⅲ級及慢性宮頸炎中miRNA－101的表達，并分析子宮頸鱗狀細胞癌中miRNA－101與HPV之間的關(guān)系，探討其在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 （1）標(biāo)本來源：收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2008年6月至2010年6月維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌、慢性宮頸炎石蠟標(biāo)本各30例，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級各15例，均未經(jīng)放療、化療、免疫治療或近期局部物理治療。所有組織均經(jīng)10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚2μm。本研究中子宮頸癌的高危型HPV數(shù)據(jù)來自組織標(biāo)本所對應(yīng)的臨床病歷資料。（2）試劑：miRNA－101探針為Exiqon公司產(chǎn)品；通用型原位雜交檢測試劑盒Ⅲ MK1031購自武漢博士德生物工程有限公司；DEPC購自美國Amresco公司。

1.2方法 所有液體試劑均需用0.1%DEPC處理或用DEPC水配置。（1）二甲苯脫石蠟，梯度乙醇脫水；（2）3%H2O2室溫作用10min；（3）胃蛋白酶（成分為1 000μL純凈水、100μL HCl、10μL濃縮胃蛋白酶）37 ℃消化30min，0.5 mol/L TBS洗滌5min×3次；（4）雜交，每張切片20μL雜交液（濃度為1∶200），將原位雜交專用蓋玻片蓋于組織上，切片置于雜交儀內(nèi)，37℃孵育14～16h；（5）37℃2×檸檬酸緩沖液（SSC），5min×2次，洗去部分非特異性結(jié)合的探針；（6）滴加封閉液，37℃孵育20min，甩去多余液體，不洗；（7）滴加堿性磷酸酶標(biāo)記小鼠抗地高辛（用0.5mol/L TBS按1∶200稀釋），37℃孵育60min；（8）BCIP/NBT顯色：按1∶20的比例用0.01mol/L TBS（pH9.5）稀釋，混勻，顯色液加至標(biāo)本上，室溫顯色10min，充分水洗，核固紅復(fù)染5～15min，水洗，水溶性封片劑封片。用已知陽性片做陽性對照，用PBS替代miRNA－101抗體作為陰性對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

miRNA－101定位于子宮頸上皮細胞細胞質(zhì)，陽性表達為細胞質(zhì)著色呈紫藍色。miRNA－101在慢性宮頸炎中表達為陽性，細胞質(zhì)彌漫性著色呈紫藍色（封3圖1）；在CINⅠ～Ⅲ級中miRNA－101陽性表達呈逐漸下降趨勢（封3圖2）；而在子宮頸鱗狀細胞癌中miRNA－101為陰性表達，癌巢中未見有藍紫色的陽性表達顆粒，因有核固紅，故組織呈現(xiàn)紅色（封3圖3）。陰性對照組全部為陰性。miRNA－101在慢性宮頸炎，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及子宮頸鱗狀細胞癌中的陽性表達率分別為80.00%（24/30）、73.33%（11/15）、46.67%（7/15）、26.67%（4/15）及10.00%（3/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝36.295，P＝0.000）。在子宮頸鱗狀細胞癌中 HPV陽性率為86.67%（26/30），其miRNA－101表達與 HPV呈負相關(guān)（r＝－0.767，P＝0.000）。在子宮頸鱗狀細胞癌高危型HPV陽性26例患者中，HPV16檢出率最高，達73.08%（19/26），明顯高于 HPV18（19.23%）及其他亞型（7.69%）（χ2＝28.500，P＝0.000）。

3 討 論

本課題組在前期研究中用miRNA微陣列芯片，檢測維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌及慢性宮頸炎組織中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)在維吾爾族婦女宮頸癌中有12個miRNA表達下調(diào)，其中 miRNA－101下調(diào)最明顯，并用RT－PCR方法驗證了芯片檢測結(jié)果［4］。miRNA－101是一類單鏈核糖核酸的負調(diào)控基因表達的非編碼小RNA。miRNA－101前體是一個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大約有70個核苷酸，在Dicer的作用下，剪切為21～24個核苷酸的成熟miRNA－101。在多種腫瘤中miRNA－101的表達下調(diào)，如胃癌［5］、結(jié)腸癌［6］、前列腺癌［7］、非小細胞肺癌［8］、肝細胞性肝癌［9］等。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－101在慢性宮頸炎上皮組織中陽性率最高，在CINⅠ～Ⅲ級中表達呈階梯樣下降，而在子宮頸鱗狀細胞癌中陽性率最低，即在子宮頸由癌前病變發(fā)展到子宮頸癌的過程中miRNA－101表達逐步降低。這與國外大多數(shù)文獻報道相一致，提示miRNA－101的表達失調(diào)可能與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。Hiroki等［10］在miRNA與子宮內(nèi)膜漿液性腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA－101表達下調(diào)，轉(zhuǎn)染miRNA－101或前體miRNA－101到子宮內(nèi)膜漿液性腺癌的細胞株中，細胞生長受抑制。Friedman等［11］對膀胱移形細胞癌中miRNA－101的表達進行研究，發(fā)現(xiàn)miRNA－101抑制膀胱移形癌細胞株中的細胞增殖和集落形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－101在CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級中均有表達，且其陽性率呈階梯樣下降，即miRNA－101在子宮頸鱗狀細胞癌前病變階段隨著病情發(fā)展其陽性率逐步下降，提示miRNA－101有可能成為新的檢測宮頸癌的早期指標(biāo)之一。這與以往文獻報道相似。Hanke等［2］研究發(fā)現(xiàn)miRNA－152可能用于膀胱癌的無創(chuàng)性早期診斷；血清標(biāo)本中的miRNA－21也可作為彌散性巨大B細胞淋巴瘤（DLBCL）非損傷性的診斷標(biāo)記物［12］，而痰液miRNA－21水平診斷法可能成為一種有效的肺癌無創(chuàng)傷檢查法［13］。

本研究通過對維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌臨床病例中高危型HPV數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽性的子宮頸鱗狀細胞癌中miRNA－101低表達，在慢性宮頸炎上皮組織中miRNA－101高表達。即在高危型HPV陽性的子宮頸鱗狀細胞癌癌組織與正常宮頸組織中miRNA－101差異表達，提示miRNA－101表達改變可能與HPV陽性子宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本研究中，高危型HPV陽性為26例，其中，HPV16檢出率最高（73.08%），明顯高于 HPV18及其他亞型，提示維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌高危型HPV感染以HPV16為主。而關(guān)于miRNA與HPV是否在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起相互作用，國內(nèi)、外研究者的看法不一。Melar－New等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的 miRNA－203抑制高危型HPV的擴增，而高危型HPV病毒蛋白也能夠抑制分化細胞中miRNA－203的表達。與此相反，Cai等［15］對 HPV31型復(fù)制周期的潛伏期和繁殖期進行miRNAs分析，發(fā)現(xiàn)的500余種細胞miRNAs中沒有一個HPV31特異的miRNAs，他們認(rèn)為HPV31及所有亞型的HPV均不表達病毒編碼的miRNAs。造成這種截然相反結(jié)果的原因可能包括：（1）研究對象的異質(zhì)性。不同的子宮頸癌組織構(gòu)成（如組織學(xué)類型、病理分期、臨床分級）和正常對照宮頸組織來源，均可能導(dǎo)致結(jié)論不一致。（2）采用不同的篩選方法及定量方法可能導(dǎo)致結(jié)果差異。因此，有必要進行大樣本、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的子宮頸癌 miRNA－101表達譜研究，以明確miRNA－101的表達變化與HPV陽性子宮頸鱗狀細胞癌之間的相關(guān)性。所以，探討高危型HPV感染及致癌過程中miRNA－101的表達特征及作用機制，對闡明HPV致癌機制和探索阻斷宮頸癌發(fā)生的新策略和新靶點具有極其重要的意義。

綜上所述，miRNA－101參與了維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展；miRNA－101與高危型 HPV感染有關(guān)；miRNA－101可能作為子宮頸癌篩查以及早期診斷的分子指標(biāo)。高危型HPV與miRNA－101在子宮頸癌中的具體作用機制有待進一步深入研究。

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