寧夏部分地區(qū)雞大腸埃希菌的分離與血清型鑒定

張燕飛，王 東＊，王玉炯，何玉龍，王建波，蒲建明，丁林軍，扈登強(qiáng)

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.銀川市農(nóng)業(yè)局，寧夏 銀川 750001；3.吳忠市畜牧局，寧夏 吳忠 751100；4.寧夏博奧藥業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750021）

禽大腸桿菌病是指由致病性大腸埃希菌引起各種禽類的急性或慢性的細(xì)菌性傳染病。隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，在病毒性疾病使用有效疫苗加以控制后，禽大腸桿菌病已上升為主要的傳染病之一[1]，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。禽大腸埃希菌的血清型眾多，國(guó)外已報(bào)道的血清型有160多種，最常見的致病血清型為 O1、O2、O78和 O35[2－4]；國(guó)內(nèi)已報(bào)道的血清型多達(dá)50余種以上，不同地區(qū)差別較大[5－8]。為調(diào)查寧夏地區(qū)雞大腸桿菌病的流行情況，給疾病防治工作提供理論依據(jù)，我們開展雞大腸埃希菌的分離和鑒定等工作，并對(duì)其血清型進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來(lái)源于寧夏銀川市、石嘴山市、吳忠市和中衛(wèi)市4個(gè)市14個(gè)縣（區(qū)）的103個(gè)規(guī)?；u場(chǎng)發(fā)生疑似雞大腸桿菌病的病雞和死雞。根據(jù)其癥狀和病變，分別以無(wú)菌方法采集心血、肝、脾、卵泡、輸卵管等材料，供作細(xì)菌分離樣品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)昆明小鼠，體重18g～20g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱、伊紅美藍(lán)和三糖鐵培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸埃希菌生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸埃希菌“O”抗原定型診斷血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng) 將病料接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h～24h；將有細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)物分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱、伊紅美藍(lán)和三糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h～24h；挑取典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，觀察分離菌形態(tài)特征。

1.2.2 生化試驗(yàn) 根據(jù)分離菌的培養(yǎng)特性、染色特點(diǎn)和形態(tài)特征，將初步篩選符合大腸埃希菌的培養(yǎng)物分別接種于各種生化反應(yīng)管中，進(jìn)行生化特性鑒定[9]。

1.2.3 致病性試驗(yàn) 每株分離菌做活菌計(jì)數(shù)后，注射6只小鼠，0.2mL／只（含細(xì)菌數(shù)目2.0億）；對(duì)照組6只，注射無(wú)菌生理鹽水，0.2mL／只。攻毒后隔離飼養(yǎng)7d，觀察發(fā)病和死亡情況。發(fā)病死亡小鼠取肝、脾做細(xì)菌分離鑒定[10－11]。

1.2.4 血清型鑒定 將有致病性的雞大腸埃希菌分離菌株分別接種普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，用5g／L石炭酸生理鹽水洗下菌落，制成濃稠菌懸液。121℃高壓2h后，用大腸埃希菌O抗原定型血清，采用玻板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，對(duì)所有分離菌株進(jìn)行血清型鑒定[12－13]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性觀察

分離菌在肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18h～24h后，培養(yǎng)基呈均勻渾濁；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、邊緣整齊、隆起、光滑、濕潤(rùn)、灰白色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上呈磚紅色菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈黑色、帶金屬光澤的菌落；在三糖鐵培養(yǎng)基上斜面和穿刺線均呈黃色。培養(yǎng)物經(jīng)革蘭染色鏡檢，可見兩端純圓、散在或成對(duì)的紅色革蘭陰性小桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇；對(duì)乳糖和蔗糖，不同菌株間存在差異；MR試驗(yàn)陽(yáng)性；VP試驗(yàn)陰性；枸櫞酸鹽陰性；硫化氫陰性；尿素酶陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性。

2.3 細(xì)菌分離

根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)結(jié)果，從寧夏部分地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)采集疑似病料151份，分離和鑒定雞大腸埃希菌109株，平均分離率為72.19%（109／151）。

2.4 致病性試驗(yàn)

將654只小鼠分為109組，每組6只，分別注射雞大腸埃希菌，隔離觀察7d，其中59株分離菌對(duì)小鼠有不同程度的致病性（死亡率33%～100%），占分離菌株的54.13%（59／109）。剖檢死亡小鼠，可見肝腫大、呈暗紅色；脾臟腫大；肺臟出血等病理變化。將死亡小鼠的肝、脾等臟器接種細(xì)菌培養(yǎng)基，均分離出大腸埃希菌。

2.5 血清型鑒定

從59株雞致病性大腸埃希菌中確定血清型種類13種38株，占致病性菌株64.41%（38／59）；優(yōu)勢(shì)血清型為 O15、O18、O78、O88，占定型菌株63.16%（24／38）。寧夏雞致病性大腸埃希菌血清型鑒定情況見表1。

3 討論

從寧夏4個(gè)地區(qū)14個(gè)縣（區(qū)）的103個(gè)規(guī)模化雞場(chǎng)采集疑似病料151份，通過(guò)分離培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，鑒定雞大腸埃希菌109株，平均分離率為72.19%（109／151）；致病性試驗(yàn)表明，59株分離菌有致病性，占分離菌54.13%（59／109），說(shuō)明雞大腸桿菌病在寧夏各地區(qū)雞場(chǎng)普遍存在，危害嚴(yán)重。

對(duì)59株雞致病性大腸埃希菌進(jìn)行血清型鑒定，除21株未能定型外，其他38株分別屬于13個(gè)血清型，包括 O15、O18、O78、O88、O2、O20、O26、O35、O11、O27、O107、O111、O139，占致病性菌株64.41%（38／59）；O15、O18、O78、O88血清型出現(xiàn)頻率較高，占定型菌株63.16%（24／38），說(shuō)明它們是寧夏地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型菌株?？股氐氖褂煤途珙A(yù)防接種是控制大腸桿菌病的主要手段。由于人們長(zhǎng)期、大量使用抗生素等藥物，藥物防治面臨耐藥性和藥物殘留困擾，使用疫苗預(yù)防禽大腸桿菌病被越來(lái)越多的養(yǎng)殖戶所采納。雞大腸埃希菌血清型較多，不同血清型的分離株間往往缺乏交叉保護(hù)，篩選本地優(yōu)勢(shì)血清型大腸埃希菌分離株制作滅活苗，更具針對(duì)性，實(shí)際應(yīng)用效果更好。因此，分離菌株的血清型鑒定工作為寧夏地區(qū)雞大腸桿菌病的防治工作提供了理論依據(jù)。

表1 寧夏雞致病性大腸埃希菌血清型鑒定Table1 The serotype identification of Pathogenic E.coli of Chickens in Ningxia

禽大腸桿菌病是由病原性大腸埃希菌引起家禽的常見細(xì)菌性傳染病，其血清型復(fù)雜多樣，國(guó)外已報(bào)道的血清型有160多種，最常見的致病血清型為O1、O2、O78和 O35[2－4]。國(guó)內(nèi)報(bào)道的血清型種類較多，云南以 O78、O11、O88為優(yōu)勢(shì)血清型[5]；河北南部以 O78、O65、O1、O93、O141為優(yōu)勢(shì)血清型[6]；湖南岳陽(yáng)地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O1、O2、O55[7]；江蘇揚(yáng)州地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為 O78、O2、O127、O18、O1[8]；遼寧錦州地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O15，O35[14]；天津地區(qū)以 O78、O88、O2、O45、O53、O145為優(yōu)勢(shì)血清型[15]等。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，寧夏地區(qū)雞大腸埃希菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O15、O18、O78、O88，與國(guó)內(nèi)其它省份報(bào)道不完全相同，說(shuō)明不同地區(qū)雞場(chǎng)存在不同血清型。另外，本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)不同雞場(chǎng)，甚至同一雞場(chǎng)、同一雞群存在不同血清型菌株，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[5，16]。

在本次試驗(yàn)中，未定血清型的菌株有21株，占待鑒定菌株的35.59%（21／59），其中有15株不與試驗(yàn)用的任何“O”多價(jià)血清發(fā)生凝聚反應(yīng)，有6株為抗原自凝，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]相似，其原因有待進(jìn)一步研究。另外，本次試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，有1株分離菌能同時(shí)與O18、O26因子血清發(fā)生明顯凝集反應(yīng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6]相似。

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