微生物源性抗氧化劑對大鼠繁殖損傷的修復作用研究

上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院

上海市獸醫(yī)生物技術重點實驗室 陳小連 孫婷婷 徐建雄＊

畜禽在氧化應激狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，使機體DNA、生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生損傷，動物表現(xiàn)為生產(chǎn)性能下降，最終導致疾病的發(fā)生甚至死亡（Valko等，2006）。動物的生產(chǎn)繁殖是一項長期的、繁重的任務，而這種長期、繁重的特殊應激必然會導致機體的損害，導致“生殖應激綜合征”（文利新和袁慧，2008）。母體長期處在生殖應激條件下，血液生理生化改變、免疫力減弱、抗病力下降、生成大量自由基，造成機體生殖功能障礙以及并發(fā)多種疾病。目前，有關自由基在生殖和性發(fā)育過程中的作用的研究相對較少。本研究以脂多糖（LPS）作為自由基的誘發(fā)劑，微生物源性抗氧化劑作為自由基的清除劑，探討自由基對大鼠繁殖性能及仔鼠生長性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 微生物源性抗氧化劑由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司提供；試驗用SD大鼠和大鼠基礎日糧購于購自上海西普爾-必凱試驗動物有限公司。LPS購于美國Sigma公司，編號為L-2880；促卵泡激素（FSH）和雌二醇（E2）放射免疫分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術有限公司。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理 試驗選用70日齡健康 SPF 級 SD 大鼠 64 只，體重（270±30）g，雌雄各半，隨機分成4組，每組16只，雌雄各半，分別為：對照組、抗氧化劑組、損傷模型組和損傷修復組。對照組和損傷模型組飼喂基礎日糧，抗氧化劑組和損傷修復組飼喂基礎日糧并在飲水中按每只每天0.8 mL添加微生物源性抗氧化劑。損傷模型組和損傷修復組在試驗的第 5、9、13、17天下午 4∶00分別按每千克體重腹腔注射1 mg LPS，對照組和抗氧化劑組在同一時間用相同方法注射等量的生理鹽水。大鼠飼養(yǎng)于動物房內(nèi)，溫度為28～32℃，相對濕度50%～60%，光照明暗各12 h，每籠8只，雌雄分飼，自由進食與飲水。

1.3 試驗方法 試驗分預試期7 d，全部飼喂基礎日糧，自由飲水；正試期開始按試驗設計飼喂試驗日糧、飲水、注射LPS和生理鹽水。在正試期的第17天，即配種前1 d，每組各取出4只雄鼠稱重，然后用頸椎脫臼法處死、解剖，迅速將其睪丸和附睪取出，剔除多余結締組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，在精密電子天平上稱重，測定睪丸和附睪的重量系數(shù)。取一側附睪用作精子分析。在試驗第18天將各組余下的4只雄鼠分別按1雄2雌的比例與對應組雌鼠合籠交配。每天下午4點合籠，次日早上8點將其重新分開，若次日早上在籠內(nèi)發(fā)現(xiàn)有乳白色、觸之較硬的固態(tài)膠狀物即為陰道栓，可判定為懷孕，連續(xù)3 d。在試驗第22天，測定每組剩余4只雄鼠睪丸和附睪的重量系數(shù)并做精子分析。

1.4 測定指標

1.4.1 雌鼠繁殖指標 記錄交配雌鼠數(shù)，計算受孕率、正常分娩率、妊娠雌鼠產(chǎn)活仔數(shù)，稱量仔鼠初生窩重、斷奶重，記錄斷奶數(shù)、計算仔鼠育成率、仔鼠日增重以及雌鼠生育綜合指數(shù)。測定雌鼠正試期第14天和第22天血清中促卵泡激素和雌二醇（E2）的濃度。

生育綜合指數(shù)＝平均每只雌鼠成活仔數(shù)×斷乳時平均仔重。

1.4.2 雄鼠生殖發(fā)育指標 計算雄鼠配種前后睪丸和附睪的重量系數(shù)，并作精子分析，計算精子數(shù)量、活動率和精子活力。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)利用SAS 6.12統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，以LSD法進行組間多重比較，試驗結果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 微生物源性抗氧化劑對雌鼠繁殖性能和生殖激素的影響 由表1可知，抗氧化劑組雌鼠受孕率最高，比對照組高16.67%，損傷模型組和損傷修復組分別比對照組低33.3%和23.81%。各組妊娠雌鼠均能正常分娩，產(chǎn)活仔數(shù)相當，其中抗氧化劑組和損傷修復組產(chǎn)活仔數(shù)均比對照組多10.00%。離乳仔數(shù)仍然是抗氧化劑組最多，其次是損傷修復組、損傷模型組、對照組。

損傷模型組仔鼠的初生重顯著低于對照組（P ＜ 0.05），其他各組之間無顯著差異（P ＞ 0.05）。在初生窩重、斷奶重和仔鼠日增重方面，損傷模型組均顯著低于其他各組（P＜0.05），其中初生窩重比對照組低16.92%，抗氧化劑組和損傷修復組的斷奶重都稍高于對照組（P＞0.05）；損傷模型組的仔鼠日增重比對照組低23.81%，抗氧化劑組比對照組高10.88%。抗氧化劑組和損傷修復組的斷奶窩重顯著高于其他兩組（P＜0.05），分別比對照組高38.63%和22.09%。損傷模型組最低，低于對照組12.34%。對照組的育成率顯著低于其他各組 （P＜0.05）。各組生育綜合指數(shù)由高到低排列依次為：抗氧化劑組>損傷修復組>對照組>損傷模型組?？寡趸瘎┙M和損傷修復組分別比對照組高125.80和74.65，損傷模型組比對照組低40.18。

由表2可見，試驗第14天，損傷修復組雌鼠血清中FSH的濃度比損傷模型組高13.92%，并且差異顯著（P＜0.05），對照組、抗氧化劑組和損傷模型組之間無顯著差異（P＞0.05）。試驗第22天損傷模型組比對照組低18.18%，且差異顯著（P＜0.05），對照組、抗氧化劑組和損傷修復組之間無顯著差異（P＞0.05）。試驗第14天，抗氧化劑組雌鼠血清中E2的濃度顯著高于其他各組，損傷模型組的顯著低于其他組（P＜0.05），損傷修復組和對照組無顯著差異。試驗第22天，抗氧化劑組雌鼠血清E2濃度顯著高于其他組 （P＜0.05），損傷模型組和損傷修復組分別比對照組高36.92%和54.51%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表1 各組雌鼠繁殖性能的比較

表2 各組雌鼠血清中FSH和E2的濃度

2.2 微生物源性抗氧化劑對雄鼠生殖發(fā)育的影響 由表3可見，試驗第17天，抗氧化劑組的睪丸系數(shù)著顯高于損傷模型組和損傷修復組 （P＜0.05），與對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）；各組附睪系數(shù)無顯著差別（P＞0.05）。各組精子數(shù)量均有顯著差異，損傷模型組顯著低于其他各組，抗氧化劑組顯著高于其他各組（P＜0.05），損傷修復組比損傷模型組多5.48×105/mL（P＜0.05）。 精子活動率各組間差異均顯著（P＜0.05），由大到小依次為抗氧化劑組、對照組、損傷修復組、損傷模型組?？寡趸瘎┙M的a級精子數(shù)明顯高于對照組和損傷組（P＜0.05），損傷修復組顯著高于損傷模型組 （P＜0.05），但與對照組和抗氧化劑組無顯著差異（P＞0.05）。

試驗第22天，抗氧化劑組的睪丸系數(shù)顯著高于其他3組（P＜0.05），其他3組間無顯著差異；對照組和抗氧化劑組的附睪系數(shù)均顯著高于損傷模型組和損傷修復組 （P＞0.05）。各組精子數(shù)量差異均顯著，其中抗氧化劑組比對照組多11.50×105/mL，損傷修復組比損傷模型組多4.52×105/mL（P＜0.05）。精子活動率各組間差異顯著，其中抗氧化劑組比對照組高4.53%，損傷修復組比損傷模型組高13.32%。抗氧化劑組的a級精子數(shù)顯著高于其他各組，對照組和損傷修復組差異不顯著，而損傷模型組的數(shù)目顯著低于其他各組。

表3 微生物源性抗氧化劑對雄鼠睪丸和附睪重量系數(shù)及精子質(zhì)量的影響

3 討論

3.1 脂多糖對大鼠繁殖性能的影響 LPS是內(nèi)毒素的主要成分，存在于革蘭氏陰性細菌的細胞壁外膜，是介導全身炎癥反應的重要物質(zhì)，它可激發(fā)免疫細胞產(chǎn)生大量炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6等，炎性細胞因子可刺激巨噬細胞產(chǎn)生大量活性氧（ROS）和活性氮中間體（RNIs），通過消耗體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、谷胱甘肽和VE等改變體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，引起氧化應激，導致機體損傷（Bharrhan等，2010）。由大量自由基造成的胚胎細胞膜脂質(zhì)過氧化和線粒體的結構異常，會使胚胎發(fā)育減緩或終止（劉斌，2002），所以本試驗中損傷模型組仔鼠的初生重和初生窩重都顯著低于對照組（P＜0.05）。同時因為內(nèi)毒素的注射導致了雌鼠乳腺的氧化損傷，減弱了其泌乳能力，所以損傷模型組仔鼠的斷奶重和斷奶窩重顯著下降，該組仔鼠的育成率也相對較低。

LPS對雌性動物生殖功能具有抑制作用，其可以抑制卵母細胞的成熟，使異常卵母細胞數(shù)增多（鄭月慧等，2006）。LPS干擾卵泡發(fā)育、成熟和排卵的機制還不清楚。因為卵泡發(fā)育和成熟受多因素的調(diào)控，其中局部E2和一些細胞因子等起重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗第14天，損傷模型組血清中FSH和E2濃度最低，說明LPS在抑制卵泡發(fā)育的同時伴有E2的下降。這和鄭月慧等（2006）的研究結果一致。故LPS抑制卵泡發(fā)育和成熟可能與抑制E2的產(chǎn)生有關。損傷模型組受孕率最低可能是由于注射LPS后體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，使生殖器官受到損傷，從而雌鼠雌激素分泌下降，雄鼠精子數(shù)量與質(zhì)量降低。

LPS對雄性動物生殖功能也有影響，表現(xiàn)降低雄鼠睪丸和附睪系數(shù)及精子密度和精液品質(zhì)。臟器系數(shù)在一定程度上可反映其功能的強弱，注射LPS降低了睪丸和附睪正常的生化狀態(tài)，在一定程度上降低了其生殖能力。這可能是因為LPS通過開放睪丸血管內(nèi)皮細胞的緊密連接，使大量的炎癥細胞（中性粒細胞等）進入睪丸間質(zhì)中，這些炎癥細胞釋放細胞因子發(fā)生炎癥反應而引起自由基增多致過氧化損傷。精子數(shù)目是衡量雄性動物生殖能力的一個指標。本試驗中，損傷模型組精子數(shù)目最少。說明注射LPS可以使精子數(shù)目大大減少，這可能是因為LPS誘導下，間質(zhì)細胞、支持細胞功能改變，致使睪丸局部生精微環(huán)境發(fā)生變化，可能導致生精障礙（薛麗英等，2000）。精子運動是正常成熟精子的一個重要功能。這種功能保證生殖過程中精卵相遇，也參與精子對卵的機械穿透作用。精子運動低下被認為是雄性動物不育的主要原因，而且比總數(shù)降低和畸形精子數(shù)增多更重要（Cai和 Marik，1989）。 本試驗中，注射 LPS組精子活動率最低，a級精子數(shù)也最少。

3.2 微生物源性抗氧化劑對大鼠繁殖性能的影響 畜禽產(chǎn)生氧化應激后，一般可通過腹膜或靜脈注射及營養(yǎng)調(diào)控等手段添加抗氧化劑來緩解（Gupta等，2009；Berg等，2004）。 本試驗用微生物源性抗氧化劑由光合菌和酵母菌等發(fā)酵生產(chǎn)，含有來源于光合菌、酵母菌及其培養(yǎng)物的胡蘿卜素、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B12、還原型 VC、槲皮酮-3-D吡喃葡萄糖（櫟素）、槲皮酮（類黃酮）、肌醇和多種微量元素的金屬衍生物，大量研究表明，這些物質(zhì)都具有抗氧化功效。

本試驗表明，添加微生物源性抗氧化劑提高了雌鼠生殖激素水平、受孕率和生育綜合指數(shù)及仔鼠的斷奶窩重和育成率，說明該抗氧化劑能提高大鼠繁殖性能和仔鼠的生長性能?？寡趸瘎┙M的E2顯著高于對照組，而且損傷修復組濃度也比損傷模型組高，說明微生物源性抗氧化劑有增強E2分泌的效果。這可能是因為許多生物類黃酮在結構上與己烯雌酚相似而具有雌性激素樣作用，對雌激素具有雙重調(diào)節(jié)作用，從而維持機體適宜的雌激素水平。尤其在體內(nèi)雌激素水平低的情況下，與雌激素受體結合，發(fā)揮其作用，表現(xiàn)出弱雌激素作用（陳輝等，2006）。E2除對生殖系統(tǒng)有影響外，還對各種外源刺激導致免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等的功能紊亂和器質(zhì)性損傷具有調(diào)整和保護作用（鄭月慧等，2006）。這也可能是添加微生物源性抗氧化劑鼠只生長性能較好的原因。

本試驗中抗氧化劑組的睪丸重量系數(shù)和附睪重量系數(shù)均比相應對照組高，損傷修復組也在一定程度上高于損傷模型組，說明微生物源性抗氧化劑在一定程度上提高了雄鼠的生殖能力，并對LPS引起的生殖損傷有一定的修復作用?？赡苁且驗槲⑸镌葱钥寡趸瘎┨岣吡松称鞴俚目寡趸芰Γ绕涫蔷徑饬薒PS造成的過氧化損傷。

抗氧化劑組大鼠精子數(shù)量高于對照組，損傷修復組相應的比損傷模型組高，精子活動率和a級精子數(shù)也呈相似的變化趨勢。這說明微生物源性抗氧化劑對大鼠精子數(shù)量有較明顯的增強作用。精子數(shù)量增加的機制可能有兩個。第一個機制是抗氧化劑激發(fā)了成熟的精子從生精上皮釋放，因而增加了精子進入流出管道系統(tǒng)的數(shù)量。另一個機制是減慢了精子通過流出管道的速度，或者是減少了對精子的吞噬（Mazaro等，2000）。正常大鼠精子被流出管道上皮吞噬僅發(fā)生于輸精管的末段。精子活動率高，a級精子數(shù)多，說明添加微生物源性抗氧化劑使精子運動能力高，生殖能力強。

4 結語

本試驗結果表明，微生物源性抗氧化劑可以提高大鼠繁殖性能，表現(xiàn)為雌鼠生育綜合指數(shù)明顯提高，血清中雌二醇含量升高，雄鼠精子數(shù)量增多，精子運動能力提高，對LPS致機體繁殖損傷有一定的修復作用。

[1]陳輝，黃仁錄，邸科前.類黃酮化合物在動物營養(yǎng)中的研究進展[J].飼料工業(yè)，2006，27（6）：10 ～ 12

[2]劉斌.小鼠早期胚胎發(fā)育過程中活性自由基生成機制初探：[碩士學位論文][D].湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學，2002.

[3]文利新，袁慧.動物生殖應激綜合征[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（7）：867 ～870.

[4]薛麗英，李杰，王更新，等.脂多糖誘導的非特異性炎癥對大鼠睪丸功能的影響[J].生殖與避孕，2000，26（2）：77 ～ 80.

[5]鄭月慧，戴育成，肖秋香，等.內(nèi)毒素對小鼠卵泡發(fā)育、成熟及排卵功能的影響及雌性激素的保護作用[J].生殖醫(yī)學雜志，2006，15（3）：188～191.

[6]Berg B M，Godbout J P，Kelley K W，et al.Alpha-tocopherol attenuates lipopolysaccharide-induced sickness behavior in mice[J].Brain，behavior，and immunity，2004，18：149 ～ 157.

[7]Bharrhan S，Chopra K，Rishi P.Vitamin E supplementation modulates endotoxin-induced liver damage in a rat model[J].American Journal of Biomedical Sciences，2010，2（1）：51 ～ 62.

[8]Cai X Q，Marik J J.Improving penetrating capacity of spermatozoa with poor motility of caffeine at coincubation with zona-free hamster ova[J].Fertility and Sterility，1989，51：719 ～ 721.

[9]Gupta A，Vij G，Sharma S，et al.Curcumin，a polyphenolic antioxidant，attenuates chronic fatigue syndrome in murine water immersion stress model[J].Immunobiology，2009，214：33 ～ 39.

[10]Mazaro R，Di Stasi L C，Vieira Filho S A，et al.Decrease in sperm number after treatment of rats with Austroplenckia populnea[J].Contraception，2000，62（1）：45 ～ 50.

[11]Valko M，RhodesC J，MoncolJ，etal.Free radicals，metalsand antioxidantsin oxidativestress-induced cancer [J].Chemico-biological interactions，2006，160：1 ～ 40.