玉米苗枯病病原菌的分離及鑒定

何 瑞，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷 030801）

玉米是我國的重要糧食作物，栽培面積僅次于小麥、水稻，居第3位。玉米產(chǎn)量的高低受多種因素影響，包括雜交種的增產(chǎn)潛力、氣候條件、栽培措施、水肥管理、病蟲害的發(fā)生等。玉米苗枯病是世界上廣泛發(fā)生、為害嚴(yán)重的玉米病害之一。近幾年，由于大量種植感病品種、種子帶菌和生長前期不良?xì)夂蛞约按址诺脑耘喙芾淼仍?，造成該病害呈現(xiàn)出發(fā)病范圍廣、發(fā)病面積大、為害程度重的趨勢，嚴(yán)重影響著我國玉米的產(chǎn)量，已成為我國玉米生產(chǎn)上亟待解決的問題[1]。其在我國發(fā)生時間較短，20世紀(jì)90年代初只在部分玉米產(chǎn)區(qū)點(diǎn)片發(fā)生，但由于種子帶菌，玉米苗枯病在我國發(fā)生的面積逐年擴(kuò)大，很快波及到我國主要的玉米產(chǎn)區(qū)。玉米苗枯病的發(fā)生受多種因素影響，種子帶菌是苗枯病發(fā)生的前提，土壤通氣性差、濕度過大、土壤中鉀素的缺乏等有助于苗枯病的發(fā)生[2-4]。致病菌有串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾谷鐮刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯絲核菌等8種，還有地方報道為串珠鐮刀菌（F.moniliforme）與禾谷鐮刀菌（F.graminearum）共同侵染，其中，串珠鐮刀菌是玉米苗枯病的主要病原菌，該致病菌為弱寄生菌，在土壤中一般可存活2～3 a。

本研究通過對致病菌分離、鑒定并利用PCR技術(shù)對其DNA進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，進(jìn)一步確定該地區(qū)苗枯病的致病菌種類及其分類地位，且對玉米苗枯病的發(fā)病規(guī)律及其癥狀進(jìn)行了研究，以期為該病的防治和抗病育種工作提供依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 玉米苗枯病病株采自山西省昔陽縣。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑包括PSA培養(yǎng)基、大米飯、Bilai，s培養(yǎng)基、DNA抽提液、PCR 擴(kuò)增藥品；儀器包括試管、培養(yǎng)皿、解剖鏡、顯微鏡、離心機(jī)、PCR儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米苗枯病病原菌的分離、純化、培養(yǎng)及保存 以常規(guī)組織分離法對采集的玉米苗枯病病標(biāo)樣進(jìn)行病原物分離。葉片組織經(jīng)消毒后，在病斑區(qū)域切取小塊，置PSA平板上于25℃下黑暗培養(yǎng)。待菌落形成后，進(jìn)行鏡檢，挑取單孢于PSA平板上純化培養(yǎng)。切取純化后培養(yǎng)物菌落邊緣的菌絲置于PSA斜面培養(yǎng)，待充分生長后，保存于4℃冰箱里。使用時挑取少量的菌種轉(zhuǎn)入PSA平板上，25℃下培養(yǎng)備用。

1.2.2 致病性測定的接種及調(diào)查方法 分離物在PSA平板上培養(yǎng)。待菌落長滿PSA平板后，用蒸餾水洗下分生孢子，配置成濃度1×106個/mL分生孢子的孢子懸浮液，再加上少許吐溫?fù)u勻，接種5個玉米健株。在植株長到6～7葉期進(jìn)行接種，接種后保濕24 h，濕度大于90%，溫度保持在25～30℃之間。10 d后調(diào)查玉米植株的發(fā)病情況，并從發(fā)病的植株上再分離病原[6]。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)特性測定 挑取少量純化的菌絲于PSA上培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)、顏色等培養(yǎng)特性，挑取分生孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。在解剖鏡和顯微鏡下觀察病原菌在玉米莖稈上形成的孢子形態(tài)，使用DFC320數(shù)碼攝像頭配合Qwin V3軟件記錄其形態(tài)并測量大小。詳細(xì)忘錄PSA平板上的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢情況[7-8]。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析

1.2.4.1 病原菌總DNA的提取 菌絲培養(yǎng)用查氏培養(yǎng)液在振蕩培養(yǎng)箱中27℃培養(yǎng)7 d，經(jīng)過濾收集菌絲，提取方法參照SDS法[8]。

1.2.4.2 rDNA-ITS擴(kuò)增與序列測定 采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4（5'-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3'），和ITS5（5'-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3'）擴(kuò)增該病原菌的ITS區(qū)，預(yù)計擴(kuò)增片段為600bp。PCR擴(kuò)增體系（50μL）為：DNA模板 1.0μL，引物 1（10μmol/L）1.0μL，引物 2（10 μmol/L）1.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，5 U Taq 酶 0.3 μL，用ddH2O使終體積達(dá)到50 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應(yīng)終止后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。委托北京天根生物工程有限公司進(jìn)行純化和序列測定。

1.2.4.3 病原菌ITS序列同源性比較 測序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的相似程度。在GenBank上選取同屬的代表性菌株，并以Gaeum annom yces gram in is

[9]作為序列分析的外群[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米苗枯病的危害與癥狀特點(diǎn)

近幾年，制種玉米苗枯病發(fā)生嚴(yán)重，并有發(fā)展趨勢，重病田發(fā)病率高達(dá)30%以上，甚至有的田塊嚴(yán)重缺苗，翻犁改種，已成為影響制種玉米高產(chǎn)、農(nóng)民增收的重要問題。玉米苗枯病主要發(fā)生在5月中下旬（玉米4～7葉期），癥狀表現(xiàn)為葉片邊緣首先出現(xiàn)黃褐色枯死條斑，個別葉片或植株出現(xiàn)萎蔫，3～5 d后葉片變青灰色或黃褐色枯死。發(fā)病株根毛初期出現(xiàn)淡黃色至黃褐色侵染點(diǎn)，1～2 d后即變?yōu)辄S褐色水漬狀壞死，嚴(yán)重時皮層腐爛，根毛脫落（圖1）。拔起病株，發(fā)現(xiàn)在根部發(fā)病部位有時出現(xiàn)白色、灰白色或粉紅色霉?fàn)钗?，即病原菌分生孢子梗和分生孢子（圖2）。

2.2 苗枯病病原菌的形態(tài)鑒定

2.2.1 培養(yǎng)性狀

從圖3可以看出，（1）生長速度：在PSA培養(yǎng)基上25℃，4 d的菌落直徑為4.6～4.7 cm。（2）PSA培養(yǎng)基上：氣生菌絲棉絮狀，白色至淡牽牛紫?；锉砻娴希锊蛔兩?。（3）米飯上：氣生菌絲為白色至粉色。（4）Bilai，s培養(yǎng)基上：氣生菌 絲粉狀，白色。

2.2.2 形態(tài)特征 （1）小型分生孢子（圖4）：數(shù)量多、橢圓形、瓜子形，串狀著生，無隔。量度：（15.4～35.5）μm×（6.2～8.8）μm。（2）大型分生孢子（圖5）：PSA培養(yǎng)基上未見。在米飯培養(yǎng)基上，孢子鐮刀形，細(xì)長，中間較直，兩端稍彎曲，向兩端變化均勻，頂胞漸尖，基孢足跟不明顯，隔膜易消解，2～4分隔，多為3分隔。量度：（44.9～64.6）μm×（7.0～9.0）μm。（3）產(chǎn)孢細(xì)胞類型：單瓶梗，產(chǎn)孢梗短。（4）厚垣孢子：無。

對病原菌分生孢子的分隔和量度進(jìn)行了抽樣測量，結(jié)果（表1）顯示，20個病害標(biāo)樣的10個病原菌株的鑒定均獲得基本一致的結(jié)果，表明山西省昔陽縣玉米苗枯病病菌的組成比較單一，根據(jù)病原菌形態(tài)特征的描述，初步鑒定該病原菌可能是串珠鐮刀菌（F.moniliforme）。

表1 分離菌株分生孢子的分隔和量度

2.3 病原菌致病性測定

將純化后的菌株重新接種到健康的玉米葉片上，回接7～9 d，接種菌絲塊、孢子懸浮液的玉米葉片全部發(fā)病，有傷口的葉片發(fā)病比無傷口的葉片早1～2 d，癥狀與田間觀察相同，對照不發(fā)?。挥冒l(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，再次獲得與原來分離菌基本一樣的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為玉米苗枯病的病原菌。

2.4 病原菌的序列分析及同源性

引起玉米苗枯病的病菌主要有串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌，為進(jìn)一步確定山西昔陽縣的玉米苗枯病是否為串珠鐮刀菌，本研究分析了該菌的ITS區(qū)序列。菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個600 bp左右的片段（圖6），經(jīng)序列測定，確定該片段長度為592 bp（圖7），與預(yù)期結(jié)果一致。將測得的序列在GenBank中進(jìn)行同源序列搜索（BLAST搜索），結(jié)果表明，所測得的序列與串珠鐮刀菌（F.moniliforme）同源性為100%，進(jìn)一步證明引起山西省昔陽縣玉米苗枯病的病原菌為串珠鐮刀菌。

圖7 串珠鐮刀菌（F.moniliforme）ITS區(qū)序列片段

3 討論

本研究將引起山西昔陽縣的玉米苗枯病的病原菌鑒定為串珠鐮刀菌（F.moniliforme），有的地方報道的苗枯病病原菌為禾谷鐮刀菌（F.graminearum），致病菌有串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾谷鐮刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯絲核菌及腐霉菌等8種，還有的地方報道為串珠鐮刀菌（F.moniliforme）與禾谷鐮刀菌（F.graminearum）共同侵染[11]。本研究表明，不同地區(qū)引起玉米苗枯病的病原菌的確存在不同，所以，明確各地的病原種類，對進(jìn)一步研究該病的發(fā)生與流行，以及通過品種改良來提高品種抗病性均具有重要意義。本研究結(jié)果還表明，山西昔陽縣發(fā)生的玉米苗枯病的病原菌在傳統(tǒng)生物學(xué)特性及致病性上無明顯差異，病原菌結(jié)構(gòu)比較單一，這對于病害的防治與抗性的選育是十分有利的。

串珠鐮刀菌（F.moniliforme）種級鑒定標(biāo)準(zhǔn)是以分生孢子的大孢子和小孢子形態(tài)為主、培養(yǎng)特征為輔和寄主范圍作參考的綜合特征來確定的，但鐮刀菌中許多種的分生孢子都較相似，對于非專業(yè)分類研究來說，單從分生孢子形態(tài)學(xué)的特征上較難鑒定苗枯病。此外，一些學(xué)者認(rèn)為，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行苗枯病的鑒定與分類通常是不適當(dāng)?shù)?。rDNAITS是介于18 SrDNA，5.8 S rDNA和28 S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速度較編碼區(qū)快，可以提供足夠多的變異來進(jìn)行種間和種內(nèi)的分子系統(tǒng)研究[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA-ITS序列分析已被廣泛應(yīng)用于各種病原真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究中。

本研究以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征為基礎(chǔ)，并對山西昔陽縣玉米苗枯病病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析和比較，從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步鑒定引起山西昔陽縣玉米苗枯病的病原菌為串珠鐮刀菌，為進(jìn)行該病害的防治和抗性品種選育研究提供了一定的理論依據(jù)。

［1］田堯甫，楊曉芳，王仁清，等.2001年漯河地區(qū)玉米苗枯病重發(fā)原因調(diào)查[J].植保技術(shù)與推廣，2001，21（12）：12-13.

［2］張玉生，邵霞，郭泗金.玉米苗枯病在魯西地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生[J].植物保護(hù)與推廣，2000，20（1）：44-45.

［3］陳舉林，蘇波，鄒仁峰，等.玉米苗枯病的發(fā)生與防治[J].植保技術(shù)與推廣，2000，20（2）：15-16.

［4］柳鳳琛，王軍，張桂蘭，等.玉米苗枯病大發(fā)生的土壤原因探討[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2000，16（3）：45-46.

［5］吳品珊，嚴(yán)進(jìn).值得關(guān)注的大豆新病害 [J].植物檢疫，2003，17（4）：226-228.

［6］王美琴，陳俊美，薛麗，等.番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：55-58.

［7］康黎芳，王云山，曹冬梅，等.仙客來葉斑病病原菌分離及防治試驗[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29（2）：65-67.

［8］趙冰，聞鳳英，王玉龍，等.青麻葉大白菜小孢子培養(yǎng)及新品種選育[J].華北農(nóng)學(xué)報，2005，20（2）：26-29.

［9］杜道海，周志剛.缺刻緣綠藻總RNA提取方法的比較研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（增刊）：103-106.

［10］ Farr D F，Castlebury L A，Rossman A Y.Morphological andmolecular characterization of Phom opsis vaccinii and additional isolates of Phomop sisfrom blueberry and cranberry in the eastern United States[J].Mycologia，2002，94：494-504.

［11］王瑞霞，田宏先，杜珍，等.內(nèi)生生防菌P1抑菌物質(zhì)對馬鈴薯環(huán)腐病菌的抗性及鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：348-351.