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    豬MMP20基因變異篩選及其與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

    2020-12-16 08:35:56吳俊靜董斌科梅書棋彭先文
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:白豬產(chǎn)仔數(shù)基因型

    吳俊靜,董斌科,喬 木,梅書棋,彭先文

    (動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,武漢 430064)

    豬的繁殖性狀是直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟收益的重要經(jīng)濟性狀,尤其是豬產(chǎn)仔數(shù)性狀,提高母豬產(chǎn)仔數(shù)對提高養(yǎng)豬業(yè)的總體經(jīng)濟效益意義重大。然而,母豬繁殖性狀多為低遺傳力的復(fù)合性狀,很難用常規(guī)育種技術(shù)進行遺傳改良,所以尋找控制母豬繁殖性狀的關(guān)鍵分子遺傳標(biāo)記,應(yīng)用于該性狀的分子輔助育種,對提高母豬繁殖性能具有重要意義。

    基質(zhì)金屬蛋白酶-20(MMP20,Matrix Metallopeptidase 20)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員,主要與牙齒發(fā)育密切相關(guān),在降解釉原蛋白方面發(fā)揮重要作用。MMP20基因的突變可導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育不良[1],與齲齒有密切關(guān)系[2]。另有文獻報道,MMP20基因缺失與神經(jīng)母細胞瘤有關(guān)[3]。以上主要是在人和鼠中的研究結(jié)果,有關(guān)豬MMP20基因的研究甚少,有關(guān)MMP20基因?qū)ωi繁殖性能的影響還未見報道。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬育種團隊通過全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)初步篩選發(fā)現(xiàn)MMP20與豬繁殖性狀相關(guān),為此,本研究擴增了豬MMP20基因序列,利用該序列進行了多態(tài)性變異位點的篩選鑒定及與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析研究,以期獲得與母豬繁殖性狀相關(guān)的新分子標(biāo)記。

    1 材料與方法

    1.1 試驗樣品

    采集了15頭梅山豬(英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社)、255頭大白豬(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場)母豬血樣,并收集大白豬群在2011—2017年期間的繁殖性狀記錄,主要包括總產(chǎn)仔數(shù)(TNB,total number born)、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA,number born alive)、出生窩重(LW,litter weight)、出生個體重(BW,birth weight of piglet)、21日 齡 活 仔 數(shù)(NAd21,number alive in 21 days of born)、21日齡窩重(LWd21,litter weight in 21 days of born)。

    基因組DNA采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒(按該試劑盒說明書進行操作)提取。

    1.2 豬MMP20基因多態(tài)性檢測

    根據(jù)豬MMP20基因的基因組序列(GenBank登陸號:NC_010451)設(shè)計引物:上游引物:5′-TCTTACAGTAGACCTTGTGCCA-3′,下游引物:5′-TGGCTTGGGACGTTGAACCT-3′。在梅山豬和大白豬中,分別取15頭豬的DNA樣本混合,進行PCR擴增,PCR反應(yīng)體系50μL,體系中各組分的濃度為100 ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μmol/L、2.5μmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。PCR的運行程序為:95℃預(yù)熱2 min;94℃變性20 s,62~57℃退火40 s(每個循環(huán)降低0.5℃),72℃延伸60 s,共11個循環(huán);94℃變性20 s,56℃退火30 s,72℃延伸60 s,共30個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,采用Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化產(chǎn)物直接送到北京奧科公司進行DNA測序,對比篩選基因變異位點。

    1.3 基因分型

    利用上述引物,采用上述PCR產(chǎn)物直接測序法在大白豬群中進行基因分型。

    1.4 統(tǒng)計分析

    采用SAS 9.0軟件的GLM模型進行標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。所采用模型為:Yij k=μ+Pi+S j+Gk+ei jk,其中Yijk為性狀表型值,μ為總體均值,Pi為胎次效應(yīng),S j為季節(jié)效應(yīng),Gk為基因型效應(yīng),eijk為隨機誤差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 豬MMP20基因多態(tài)性檢測結(jié)果

    通過對梅山豬和大白豬兩個DNA混合樣本池進行MMP20基因片段擴增測序,在兩個品種豬中均檢測到豬MMP20基因第3內(nèi)含子中2個堿基突變位點,即位于該基因序列第14334 bp處的C>G堿基突變(g.14334 C>G)和第14369 bp的T堿基突變(g.14369 C>T),如圖1所示。

    圖1 豬MMP20基因第3內(nèi)含子2個堿基突變位點的測序圖譜

    2.2 關(guān)聯(lián)分析

    在255頭大白豬群及其共計868條胎次繁殖性狀記錄中分析了豬MMP20基因2個突變位點(g.14334bpC>G和g.14369bpC>T)基因型與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大白豬群體中g(shù).14334bpC>G和g.14369bpC>T兩個位點完全連鎖,群體中只存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。將3種基因型與母豬繁殖性狀進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型的母豬產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、出生個體均重及21日齡窩重性狀均差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)(表1)。GG/CC基因型個體產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與21日齡活仔數(shù)均顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體(P<0.05),產(chǎn)仔數(shù)存在GG/CC<GC/CT<CC/TT的關(guān)系。雖然,GG/CC基因型個體的出生個體重顯著高于GC/CT和CC/TT基因型個體(P<0.05),但出生窩重顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體(P<0.05)。

    表1 豬MMP20基因突變與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計結(jié)果

    3 小結(jié)與討論

    本研究鑒定獲得了豬MMP20基因第3內(nèi)含子中的2個單堿基突變位點g.14334bpC>G和g.14369bpC>T。這兩個突變位點在基因組上間距35 bp,在本試驗檢測的大白豬群中完全連鎖,僅存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。經(jīng)與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),這兩個突變位點顯著影響母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、21日齡活仔數(shù)、出生個體重和出生窩重等繁殖性狀(P<0.05),并且產(chǎn)仔數(shù)性狀存在GG/CC<GC/CT<CC/TT的關(guān)系。因此,MMP20基因第14334 bp處的C等位基因以及第14369 bp處的T等位基因是產(chǎn)仔數(shù)的優(yōu)勢等位基因,在育種中應(yīng)予以保留攜帶這些優(yōu)勢等位基因的個體,有利于提高群體的產(chǎn)仔數(shù)性狀。

    MMP20是新發(fā)現(xiàn)的一種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),具有鈣離子結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活化等功能,參與新陳代謝、蛋白水解等過程。目前該基因的研究多集中于口腔疾病方面,與牙釉質(zhì)疾病、食管癌、喉癌、舌癌相關(guān)[4]。近年來也有研究表明MMP20蛋白與子宮內(nèi)膜癌及預(yù)后不良有關(guān)[5];該基因的突變與卵巢癌發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)[6]。但未見報道此基因與繁殖性能相關(guān),但是MMPs在月經(jīng)周期、排卵、胎盤形成、產(chǎn)后子宮恢復(fù)等過程中起重要作用[7]。郭敏等[8]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中MMPs水平升高,可能與盆腔粘連的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān);高揚等[9]也發(fā)現(xiàn)MMPs與子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥有關(guān);王卉菲等[10]報道MMPs蛋白參與影響胎盤淺著床過程;MMPs與雙胎早產(chǎn)也有密切的關(guān)系[11]。有關(guān)豬MMP20的研究極少,本研究發(fā)現(xiàn)了豬MMP20基因的2個遺傳突變位點顯著影響母豬繁殖性狀,然而其具體作用機制還需要做更深入的基因功能分析與研究。

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