結(jié)核分枝桿菌CFP21抗原的HLA-A*0201/*03限制性細胞毒T淋巴細胞表位預(yù)測*

翟文杰，翟明霞，呂 虹，祁元明，高艷鋒

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種慢性傳染病，目前仍然是發(fā)病率和病死率較高的一種傳染病。近年來，結(jié)核桿菌和人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)造成個體機會性感染更加嚴重［1］。傳統(tǒng)預(yù)防結(jié)核病的卡介苗(BCG)免疫效果不穩(wěn)定，對預(yù)防成年人肺結(jié)核缺乏有效性，并且隨著結(jié)核桿菌多重耐藥菌株的出現(xiàn)［2］，新型抗結(jié)核疫苗的研制變得更加迫切。結(jié)核桿菌分泌蛋白CFP21能夠誘導(dǎo)結(jié)核鼠及結(jié)核患者產(chǎn)生高水平的腫瘤壞死因子-γ(tumor necrosis factor-γ，TNF-γ)［3］，具有高度的免疫原性，是結(jié)核疫苗設(shè)計的候選抗原。因此，尋找CFP21抗原的HLA-I限制細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位對開發(fā)安全高效的新型結(jié)核疫苗具有非常重要的意義。通過作者所在的課題組前期對CFP21抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位的研究［4-5］，預(yù)測在CFP21抗原中可能存在 HLA-A*03限制性 CTL表位［6］。通過抗原肽修飾改造［7］、結(jié)合力分析［8］和細胞毒活性［9］等實驗，鑒定結(jié)核分枝桿菌CFP21抗原同時針對HLA-A*0201/*03型別的廣譜CTL表位，為今后開發(fā)適應(yīng)更廣泛人群的結(jié)核疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本與細胞株 HLA-A*03+PPD+健康供者的外周血來自實驗室的志愿者?？乖嚯霓D(zhuǎn)運蛋白(TAP)缺陷的T2A3細胞由美國紐約血液中心安秀麗教授惠贈。

1.2 主要試劑和實驗器材 RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，二甲基亞砜(DMSO，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)，重組人 β2微球蛋白(rβ2-M)、絲裂霉素 C、重組鼠抗人rβ2-M單抗及細菌脂多糖(LPS)(Sigma公司)，尼龍毛柱(Wako公司)，F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rGM-CSF)與白細胞介素-4(rIL-4)(Peprotech公司)，乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒活性檢測試劑盒(Promega公司)。反相高效液相色譜儀(島津公司)，BRUKER Esquire-3000電噴霧-離子阱多級質(zhì)譜儀(ESI-MS，德國布魯克道爾頓儀器公司)，流式細胞儀(Becton Dickinson公司)。

1.3 表位預(yù)測和多肽合成 CFP21抗原氨基酸全長序列從 NCBI網(wǎng)站獲取，共 217個氨基酸，CAA98399.1。采用在線數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI初步預(yù)測，結(jié)合 BIMAS 和 NetCTL 1.2 在線［10］分析，對比HLA-A*0201 的預(yù)測結(jié)果［4］，針對 HLA-A*03 型別進行CFP21抗原的天然表位預(yù)測。選取評分結(jié)果較好的表位肽作為母體肽。對母體肽按1Y、2L和(或)9L進行氨基酸置換，獲得改造肽，對已經(jīng)篩選出來的表位，采用標準Fmoc方案合成多肽，產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC分析、純化，獲得純度高于95%的九肽產(chǎn)物。經(jīng)ESI-MS測定，相對分子質(zhì)量與理論值相符合。陽性肽的合成參照文獻［5］。

1.4 T2A3細胞結(jié)合力實驗 取T2A3細胞(1×109L－1)置于含有 rβ2-M(3 mg/L)的無血清 RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入候選肽(50 mg/L)，37℃孵育18 h;然后洗2次，加100 μL按1∶100稀釋的一抗(鼠抗人rβ2-M)，4℃ 暗處孵育 30 min后洗3次，加入50 μL按1∶50稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，4℃反應(yīng)30 min;收獲細胞后上流式細胞儀檢測。結(jié)果以熒光系數(shù)(FI)表示。FI=(表位肽平均熒光強度－背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。

1.5 細胞毒活性實驗 取HLA-A*03+PPD+健康供者的外周血，分離獲得外周血單個核細胞(PBMCs)，尼龍毛柱法分離T淋巴細胞，保存?zhèn)溆?。PBMCs經(jīng)rGM-CSF、rIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)，2 d半量換液1次;培養(yǎng)至第5天，加100 μg/L LPS誘導(dǎo)成熟，48 h后收集細胞，即成熟的樹突狀細胞(DC)。無血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌成熟DC，重懸后加入候選肽(10 mg/L)和 rβ2-M(3 mg/L)培養(yǎng)4 h;收集細胞，用培養(yǎng)基洗滌3次去除多余的多肽;重懸后加入絲裂霉素C(50 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用培養(yǎng)基洗滌3次，重懸細胞。以分離的T淋巴細胞作為反應(yīng)細胞，荷肽的DC作為刺激細胞，按T淋巴細胞每孔1×106個，荷肽的DC每孔1×105個，加入24孔板中，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日添加rIL-2(1×105U/L)，每2～3 d半量換液且補足rIL-2;7 d后收集細胞;以同樣的方法進行3輪刺激。最后1次刺激后第5天，收集細胞，獲得CTL。使用非放射性LDH細胞毒活性檢測試劑盒測試細胞毒活性。以荷肽(50 mg/L)的 T2A3作為靶細胞(1×104個/孔)，按照不同效靶比(20∶1和40∶1)加入效應(yīng)細胞CTL，37℃共培養(yǎng)5 h后進行LDH釋放量檢測。參照文獻［5］計算細胞特異殺傷率。

2 結(jié)果

2.1 表位預(yù)測結(jié)果 經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測，獲取 4條評分顯著高于其他CTL表位的母體肽;對第1、2和9位氨基酸殘基進行替換后通過3個數(shù)據(jù)庫的綜合預(yù)測，獲得3條分值較高的改造肽，見表1。

表1 候選表位肽的在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果

2.2 結(jié)合力實驗和細胞毒活性實驗結(jié)果 T2A3細胞結(jié)合力實驗結(jié)果顯示，母體肽中p134與HLA-A*03分子的結(jié)合力較高，F(xiàn)I為0.90;改造肽 p134-1Y2L、p134-1Y2L9L與HLA-A*03分子的結(jié)合力也較高，F(xiàn)I分別為1.10和0.70。細胞毒活性實驗檢測發(fā)現(xiàn)，母體肽中p134對靶細胞具有比較明顯的殺傷效應(yīng)，效靶比為20∶1和40∶1時，細胞特異殺傷率分別為12.1%和37.4%。改造肽 p134-1Y2L9L對靶細胞的殺傷效率較低，效靶比為20∶1時，細胞特異殺傷率為12.0%，效靶比為40∶1時僅為24.1%;而 p134-1Y2L并未表現(xiàn)出明顯的殺傷作用。

3 討論

分泌蛋白以及細胞壁蛋白是結(jié)核桿菌主要的免疫保護抗原。位于Mtb基因組和BCG差別區(qū)(RD區(qū))內(nèi)的分泌蛋白由于其在BCG中的缺失，逐漸成為疫苗候選抗原的熱點。優(yōu)勢抗原表位的鑒定對發(fā)展更有效的結(jié)核病治療性多表位肽疫苗具有重要的意義。結(jié)核桿菌分泌蛋白CFP21位于RD2區(qū)，具有高度的免疫原性。CFP21能夠誘導(dǎo)結(jié)核感染者產(chǎn)生T淋巴細胞增殖反應(yīng)以及釋放高水平TNF-γ，發(fā)揮細胞殺傷作用，是抗結(jié)核疫苗設(shè)計的理想候選抗原［3，11-12］。

與全蛋白疫苗相比，基于表位的多肽疫苗不僅可以有目的性地選擇優(yōu)勢表位，舍棄不利于免疫應(yīng)答的表位，從而誘導(dǎo)更有效的反應(yīng);還能夠克服使用整個重組蛋白所涉及的潛在的安全性問題。而設(shè)計基于CTL表位的結(jié)核多肽疫苗的首要工作則是結(jié)核抗原表位的鑒定，但迄今為止，已被鑒定出的結(jié)核桿菌 CTL表位的數(shù)量很少［10，13-15］。該研究中，作者通過“反向免疫學(xué)”方法從HLA-A*0201候選肽中鑒定CFP21的HLA-A*03表位，該方法是目前常用的一種比較有效的鑒定HLA限制性CTL表位的方法。作者以在線數(shù)據(jù)庫 SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL 1.2為基礎(chǔ)，對比 HLA-A*0201的預(yù)測結(jié)果［4］，初步篩選 CFP21的 HLA-A*03天然表位。已有文獻［6］報道，通過對抗原表位錨定位點的氨基酸替換，能夠增強表位與HLA-Ⅰ分子的結(jié)合力。因此，作者通過將天然表位按1Y、2L和(或)9L進行氨基酸置換，獲得改造肽。通過T2A3細胞結(jié)合力的初步篩選，在7條候選肽中，只有母體肽 p134和相應(yīng)的2條改造肽可用于后續(xù)的體外免疫活性檢測。目前研究者大多采用ELISPOT、標準51Cr釋放法和 LDH釋放法［9］等檢測收獲的抗原特異性 CTL免疫活性。該研究中作者采用經(jīng)絲裂霉素C處理和抗原肽孵育后的 DC為刺激細胞，與自身T淋巴細胞共培養(yǎng)，經(jīng)3～4輪刺激后，收獲抗原特異性CTL，通過LDH釋放法檢測其活性，結(jié)果顯示，母體肽p134以及2條改造肽p134-1Y2L和p134-1Y2L9L都能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，但只有p134誘導(dǎo)出的CTL對靶細胞具有明顯的殺傷效應(yīng)。

綜上所述，p134(AVADHVAAV)是一個針對HLA-A*03的表位。結(jié)合課題組前期對CFP21的HLA-A*0201限制性表位的研究，作者認為p134(AVADHVAAV)表位能有效激發(fā)HLA-A*0201/*03限制性CTL的免疫應(yīng)答，是一個多等位基因廣譜CTL表位。

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