四種中藥對(duì)感染牙本質(zhì)小管糞腸球菌的抑制作用

于靜 胡永權(quán) 王貴花 戴東曉 李君如 謝景朝 王榮霞 趙發(fā)銀

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）常見于口腔內(nèi)科根管治療失敗的再感染根管中。根 管 治 療 后 疾 病 （post－treatment endodontic disease，PED）患牙根管中糞腸球菌的感染率各學(xué)者的報(bào)道不一［1－4］，但均認(rèn)為PED患牙根管中糞腸球菌為優(yōu)勢菌。目前，臨床常用的根管消毒藥物在使用中或多或少存有欠缺，因此，需要尋找一種安全有效的根管消毒藥物來殺滅牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌。中藥具有獨(dú)特的消炎、殺菌和解毒等功效，且毒副作用小。本實(shí)驗(yàn)選用黃連、五味子、大黃、連翹的水煎劑分別作為試驗(yàn)藥物，以臨床常用的根管消毒藥甲醛甲酚 （formocresol，F(xiàn)C）作對(duì)照，在新鮮的離體人牙上觀察其對(duì)糞腸球菌的抑制作用，以期對(duì)四種中藥的抗糞腸球菌性能作初步評(píng)價(jià)，為臨床進(jìn)一步研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑［四種中藥飲片各50g分別加500ml水，浸泡并經(jīng)兩次熬制濃縮成50ml，高壓滅菌得每毫升相當(dāng)于原藥材1g（1∶1）的中藥水煎劑，待冷卻后置于4℃冰箱備用］。甲醛甲酚（FC）（武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔藥物材料廠，批號(hào)100525）。無菌生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：101227407）。普通血瓊脂培養(yǎng)基（90mm，鄭州安圖綠科生物工程有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電子分析天平（MA240D型，上海第二天平儀器廠）；全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器（Model LS－B75L－Ⅱ，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東省濰坊醫(yī)療器械廠）；數(shù)字顯示比濁儀（100%T，上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司）；一次性使用細(xì)菌培養(yǎng)皿（直徑為90mm，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS－212，日本奧林巴斯儀器公司）；15＃－40＃H型根管銼（MANI.日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌種

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）臨床菌株1株，石家莊市第二醫(yī)院細(xì)菌室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及分組

選擇因正畸治療拔除的新鮮單根管牙84顆，冷凍－20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｅ懦荔w齲壞及髓或牙根面齲者、牙根不完整或牙根未發(fā)育完全，根尖孔未完全形成或敞開及牙根表面存在細(xì)小裂紋者。84顆離體牙分別編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表依次將牙齒分入陰性對(duì)照組、甲醛甲酚組、黃連水煎劑組、五味子水煎劑組、大黃水煎劑組、連翹水煎劑組、陽性對(duì)照組，共為7組，每組12顆。見表1。

表1 7組牙根根管的處理情況

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 牙齒預(yù)備 將84顆離體牙浸泡于5.25%NaCl 0溶液，24小時(shí)后常規(guī)開髓、揭頂、去冠髓、拔髓，采取逐步后退法預(yù)備根管致40＃大小，配以5.25%NaCl 0溶液與17%EDTA溶液交替沖洗及超聲蕩洗。用高速金剛砂車針去除牙齒冠部及根尖部，留取6mm高的柱狀牙根。將制備好的牙根置于含有25ml牛心腦浸液（BHI肉湯）的試管中，121℃高溫、高壓下滅菌15分鐘，置于5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)，24小時(shí)后觀察BHI肉湯無渾濁，以確定滅菌完全。

1.5.2 制備標(biāo)準(zhǔn)菌液 復(fù)蘇并鑒定糞腸球菌，將其接種于BHI肉湯中，用比濁儀調(diào)整濁度為0.5M（透光度為80%T）的標(biāo)準(zhǔn)菌液備用。

1.5.3 建立根管感染模型 將72顆牙根置于已制備的含糞腸球菌的菌液中，置于5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)（以利于糞腸球菌感染根管）。24小時(shí)后取出各牙根，用無菌生理鹽水蕩洗根管，無菌吸潮紙尖干燥根管，用蠟將牙根固定于一次性細(xì)菌培養(yǎng)皿的底部（注意底部根管口封閉完全）。

1.5.4 放置根管消毒劑及檢測消毒效果 用一次性無菌注射器將藥劑按分組方法輸送至每顆牙根的根管內(nèi)（見表1）。將放置牙根的各組培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)，至第3天時(shí)每組各取出6顆牙根，去除根管內(nèi)試驗(yàn)藥物，用無菌生理鹽水沖洗、無菌吸潮紙尖干燥后用慢速G鉆均勻磨取根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末，用電子天平稱取4mg，置于含有20ml BHI肉湯的無菌試管內(nèi)，5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)72小時(shí)后取試管內(nèi)上層液體，比濁儀測量上層液體的透光度，并記錄數(shù)據(jù)。培養(yǎng)至第7天時(shí)取出每組剩余6顆牙根，作上述處理及檢測。透光度數(shù)值接近陰性對(duì)照者，證明其抑菌效果好；反之接近陽性對(duì)照者，其抑菌效果較差。在測量透光度的同時(shí)，各組分別取少量上層液體接種于普通血瓊脂培養(yǎng)基上，5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。進(jìn)行快速革蘭染色，生物顯微鏡下鑒定BHI肉湯試管內(nèi)細(xì)菌的種類。鏡下觀察為G＋球菌，呈橢圓形，符合糞腸球菌鏡下形態(tài)，無其他細(xì)菌生長。證明實(shí)驗(yàn)過程無污染。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。因各組數(shù)據(jù)方差不齊且非正態(tài)分布，選擇秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)3天時(shí)透光度比較

7組培養(yǎng)物上層液體透光度比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組牙本質(zhì)小管中殘留細(xì)菌量較陽性對(duì)照組均明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩者殘留的細(xì)菌量最少，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；連翹水煎劑組與陽性對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)7天時(shí)透光度比較

7組培養(yǎng)物上層液體透光度比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），該兩組與陰性對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但數(shù)值很接近；與陽性對(duì)照組有差別且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；連翹水煎劑組與陽性對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較（±s，﹪）

表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較（±s，﹪）

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3 討論

糞腸球菌多存在于根管充填完善但仍有持續(xù)根尖損害的根管中，是導(dǎo)致根管治療失敗的主要病原菌。本研究參考Haapasalo及?rstavik的實(shí)驗(yàn)方法［5］將糞腸球菌植入離體牙根管內(nèi)，并模擬口腔溫度及厭氧環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，制備感染根管內(nèi)牙本質(zhì)小管的體外模型，觀察臨床常用根管消毒藥物及四種中藥的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)?zāi)鼙容^準(zhǔn)確的模擬口腔內(nèi)環(huán)境，比較直觀的反映實(shí)際情況，所得結(jié)果可信且具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

根管治療步驟包括根管預(yù)備、消毒和充填，有研究發(fā)現(xiàn)根管經(jīng)過預(yù)備后，雖然根管內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量明顯減少［6］，卻不能完全被殺滅。由此可見應(yīng)用有效的藥物消毒是很有必要的。而藥物消毒的效果則主要取決于根管消毒劑。因此，本實(shí)驗(yàn)選用臨床常用并公認(rèn)消毒效果較好的甲酫甲酚作為對(duì)照組，觀察黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑對(duì)離體人牙根管內(nèi)糞腸球菌的抑菌效果，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀、更具說服力。

為了更精確地反映中藥的抑菌作用 ，筆者還選擇了對(duì)腸球菌的體外抗菌活性檢測有較好的抑菌效果［7－9］的六種中藥（黃連、五味子、大黃、連翹、烏梅、黃芩），應(yīng)用M－H瓊脂進(jìn)行了六種中藥對(duì)糞腸球菌抑菌活性的檢測，并選出其中抑菌效果較好的中藥黃連、五味子、大黃、連翹進(jìn)行了對(duì)感染牙本質(zhì)小管糞腸球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連水煎劑對(duì)糞腸球菌的抑菌作用優(yōu)于其他參試中藥，其抑菌效果與甲酫甲酚無差別，考慮與黃連的主要抑菌成分黃連素（小檗堿）有關(guān)。黃連素具有廣譜抗菌作用，低濃度抑菌，高濃度殺菌。其作用機(jī)制可能是：（1）破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)；（2）抑制細(xì)菌糖代謝，黃連能抑制酵母菌及細(xì)菌糖代謝的中間環(huán)節(jié)丙酮酸的氧化脫羧過程；（3）抑制核酸、蛋白質(zhì)合成。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)一步證明了黃連有很好的抑制糞腸球菌作用，具備成為新的根管消毒藥物的潛能。且中藥水煎劑制備相對(duì)簡便，毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，因此進(jìn)一步將其用于臨床是十分經(jīng)濟(jì)和安全有效的。

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