FQ-PCR技術(shù)在小兒結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用

劉彥軒，賈安奎，郭盛菊，尚好珍

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453100;2河南省結(jié)核病醫(yī)院)

結(jié)核性腦膜炎(簡稱結(jié)腦)是小兒時(shí)期最常見和最嚴(yán)重的肺外結(jié)核病之一，病死率高達(dá)30% ～50%，幸存者中20% ～50%遺留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥(如偏癱、失語、失明等)，早期診斷是決定患兒預(yù)后的關(guān)鍵因素［1］。目前臨床診斷結(jié)腦多依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法敏感性低、耗時(shí)長。陳效友等［2］研究顯示，以Taq酶標(biāo)記的熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測痰和血標(biāo)本中結(jié)核菌(TB)靈敏度高達(dá)10fg DNA和1～5個(gè)菌體/mL，靈敏度比普通PCR高10～100倍。2009年3月～2011年2月，我們應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)對30例結(jié)腦患兒腦脊液中TBDNA進(jìn)行了檢測，并與抗酸桿菌涂片、TB培養(yǎng)、TBAb、腺苷酸脫氨酶(ADA)活性指標(biāo)進(jìn)行了比較，旨在為結(jié)腦早期診斷提供一個(gè)較適宜的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期收治的結(jié)腦住院患兒30例(結(jié)腦組)，男、女各15例，年齡6個(gè)月～12歲(平均5.7 歲)，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(18.3 ±1.6)kg/m2。均符合胡亞美主編第2002版《實(shí)用兒科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，未進(jìn)行腦脊液檢查的結(jié)腦患兒［1］排除。另設(shè)我院收治的非TB感染性腦膜炎或腦炎患兒為對照組，男、女各15例，年齡5個(gè)月 ～12歲(平均5.5歲)，BMI為(19.1 ±1.7)kg/m2;均根據(jù)臨床表現(xiàn)、腦脊液蛋白增加或葡萄糖量降低，一般抗生素治療有效或腦脊液中查到特異性病毒抗體IgM，或培養(yǎng)出一般細(xì)菌等診斷［3］，其中病毒性腦膜炎18例、化膿性腦膜炎6例、隱球菌腦膜炎3例、腦膜瘤2例、流行性乙型腦炎1例。兩組年齡、性別等一般資料具有可比性。

1.2 腦脊液中相關(guān)指標(biāo)檢測 ① TB-DNA:采用FQ-PCR法(中山大學(xué)達(dá)安基因公司產(chǎn)DA7600型擴(kuò)增儀)。取腦脊液沉淀100μL加入等量濃縮液，振蕩數(shù)秒，以12 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入50μL DNA提取液，置于100℃恒溫金屬浴10 min。以12 000 r/min離心10 min，取上清液2μL加入毛細(xì)管進(jìn)行PCR反應(yīng)，每批加有陰、陽性質(zhì)控品和4個(gè)濃度的TB陽性定量參考品，擴(kuò)增檢測步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行，擴(kuò)增曲線呈s型，且ct值＜30、TB-DNA含量＞5.0×10拷貝/mL為陽性。②抗酸桿菌涂片、TB培養(yǎng):腦脊液盲法編號后進(jìn)行沉渣涂片抗酸染色鏡檢、改良羅氏法培養(yǎng)TB。③TB-Ab 、ADA 活性:應(yīng)用結(jié)明(MyCoDot.TM)結(jié)核病快捷診斷試劑盒(美國Dyna-Gen公司)檢測TB-Ab，操作參照說明書進(jìn)行;采用奧林巴斯 OLYMPUS AU2700全自動(dòng)生化分析儀及北京利德曼ADA測定試劑盒檢測ADA活性，按說明書操作(正常參考值0～8 U/L)。上述方法檢測陽性標(biāo)本經(jīng)抗結(jié)核治療3周后復(fù)檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用CS2000統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t或t'檢驗(yàn)，兩樣本率比較采用四格表法Pearson χ2或 Yatesχ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同指標(biāo)初檢情況 結(jié)腦組TB-DNA檢測陽性率顯著高于抗酸桿菌涂片、TB羅氏培養(yǎng)、TB-Ab(χ2=4.444 4)，但與 ADA 比較無顯著差異(χ2=0.266 7)。對照組 ADA有 6例升高，其特異性(80%)低于其他四種指標(biāo)(100%)，χ2=4.629 6，見表1。

表1 不同指標(biāo)初檢結(jié)果比較

2.2 初診檢測陽性標(biāo)本抗結(jié)核治療3周后復(fù)檢情況 結(jié)腦組16例TB-DNA陽性患者及14例ADA活性陽性患者復(fù)檢均轉(zhuǎn)陰;對照組6例ADA活性陽性患者復(fù)檢仍為陽性。

3 討論

結(jié)腦是肺外結(jié)核中最具威脅的疾病，早期病死率不足10%，但晚期可達(dá)60%以上，故早期診斷意義重大［4］。腦脊液能直接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化，是檢測的理想標(biāo)本，其中細(xì)菌學(xué)病原體檢查是實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)腦的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但結(jié)腦患兒腦脊液中含菌量太低，加之基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)不規(guī)則治療常致低活力菌和L型菌等細(xì)菌生物學(xué)性狀發(fā)生改變［5］，導(dǎo)致細(xì)菌涂片、培養(yǎng)敏感性更低，腦脊液常規(guī)生化改變不典型，很容易漏診。本研究顯示，抗酸桿菌涂片陽性率為0、TB培養(yǎng)陽性率為6.7%，與文獻(xiàn)［6］報(bào)道基本一致。此外，TB培養(yǎng)時(shí)間約5周，無法滿足臨床早期診斷結(jié)腦的需要。

FQ-PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)基團(tuán)，通過熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)、自動(dòng)監(jiān)測整個(gè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的積累，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及對未知模板進(jìn)行定量分析的方法，其TaqMan探針對目標(biāo)序列特異性高，可用于目標(biāo)基因的檢測和定量，特別適用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測［7］。此外，F(xiàn)Q-PCR全“封閉”式的操作、dUPT-UNG酶防污染體系的設(shè)立，在相當(dāng)程度上解決了普通PCR難以避免的實(shí)驗(yàn)污染問題;比普通PCR后的電泳檢測靈敏度高2～3個(gè)數(shù)量級［8］。而傳統(tǒng)涂片抗酸桿菌染色法需每毫升痰標(biāo)本達(dá)5 000～10 000條菌以上才可能檢出陽性結(jié)果［9，10］;改良羅氏培養(yǎng)法的靈敏度可達(dá)10條/mL，但一般需要6～8周才能報(bào)告結(jié)果［10］。

本研究顯示，結(jié)腦組TB-DNA陽性率明顯低于TB-Ab，但對照組兩者陽性率均為0。提示此兩指標(biāo)特異性均為100%，但FQ-PCR所測TB-DNA具有更高的敏感性，可降低結(jié)腦漏診率。本研究還顯示，結(jié)腦組TB-DNA和ADA陽性率相似，但對照組ADA陽性率顯著高于結(jié)腦組，且6例ADA陽性病例經(jīng)抗結(jié)核治療后復(fù)檢ADA結(jié)果仍呈陽性。提示此兩指標(biāo)均有較好的敏感性，但ADA特異性偏低，可能造成誤診率增加。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR檢測腦脊液中TB-DNA較其他傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測方法更具特異性和敏感性，且操作簡便、快速，可作為結(jié)腦早期輔助診斷、預(yù)后觀察和療效評價(jià)的有力手段。

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