HPLC法測(cè)定羚羊感冒顆粒中的牛蒡子苷含量

吳伯英

羚羊感冒顆粒具有清熱解表之功能，用于流行性感冒，傷風(fēng)咳嗽，頭暈發(fā)熱，咽喉腫痛等癥[1]，處方由羚羊角、金銀花、桔梗、連翹、牛蒡子、荊芥穗、淡豆豉、淡竹葉、甘草、薄荷腦、薄荷素油等11味中藥組成。原標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定指標(biāo)，為了有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，保證其療效，我們對(duì)該品種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提高研究，由于牛蒡子具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽的作用，是羚羊感冒顆粒的主要藥味。故選擇牛蒡子中所含牛蒡苷作為指標(biāo)成分，本文采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，獲得滿意的結(jié)果，方法準(zhǔn)確可靠。

1 試劑與試藥

高效液相色譜儀（美國Waters公司），配置（Waters2695泵，Waters2487檢測(cè)器，Empower色譜工作站，色譜柱Kromasil C18150mm×4.6mm，5μm），電子分析天平（塞多利斯Sartorius BP-210D型，十萬分之一）。牛蒡子苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供, 批號(hào) 110819 -200505)；羚羊感冒顆粒樣品共7批：黑龍江省濟(jì)仁藥業(yè)有限公司提供3批中試樣品（批號(hào)060101、060102、061101），太極集團(tuán)重慶桐君閣制藥廠提供4批中試樣品（批號(hào)77060001、77060002、77060003、010404001）；缺牛蒡子陰性對(duì)照樣品：自制。流動(dòng)相用甲醇為色譜純（SIGMA-ALDRICH 批號(hào)S93191），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱: Kromasil C18（100mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：35℃；流速：0.5mL.min-1。

2.2 供試品溶液的制備

取本品顆粒約2.5g，精密稱定，置具塞瓶中，精密加入50 %甲醇，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取牛蒡子苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.4 陰性對(duì)照品的制備

取羚羊角0.5g，研成細(xì)粉，淡豆豉10g，用60%乙醇、25%的乙醇作溶劑進(jìn)行滲漉；漉液蒸至無乙醇味，濃縮成稠膏，備用；連翹24g、荊芥穗12g，蒸餾提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器收集；藥渣與金銀花24g、桔梗16g、淡竹葉12g、甘草10g用蒸餾后的水溶液加水煎煮二次，每次0.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液與清膏合并，濃縮至約98mL，靜置24小時(shí)，取上清液，濃縮至相對(duì)密度為1.38～1.40(80℃)的清膏。取清膏、蔗糖粉42.5g、淀粉42.5g及羚羊角細(xì)粉，混勻，制成顆粒，干燥，加入薄荷腦0.1g，薄荷素油0.1mL及上述連翹等揮發(fā)油，混勻，制成100g，即得缺牛蒡子的陰性對(duì)照品。

2.5 方法學(xué)考察

圖1 羚羊感冒顆粒(缺牛蒡子)HPLC圖譜

圖2 牛蒡子苷對(duì)照品HPLC圖譜

2.5.1 專屬性考察 取缺牛蒡子的陰性對(duì)照品，按上述規(guī)定的方法進(jìn)樣分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，缺牛蒡子的陰性對(duì)照品色譜中，在與牛蒡子苷對(duì)照品色譜峰相同保留時(shí)間處無色譜峰（見圖1、圖2），說明本方法無陰性干擾，專屬性強(qiáng)。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 按上述規(guī)定的方法將新配制的牛蒡子苷對(duì)照品溶液精密進(jìn)樣10μL以及新制備的供試品溶液（批號(hào)：060101）精密進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，以后每間隔一定時(shí)間測(cè)定一次，記錄牛蒡子苷色譜峰面積的變化。結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照品溶液的RSD和供試品溶液的RSD均小于2.0%，說明對(duì)照品溶液與供試品溶液均在24h內(nèi)均穩(wěn)定。

表1 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5.3 精密度考察 精密吸取供試品溶液和牛蒡子苷對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄牛蒡子苷色譜峰峰面積，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

表2 精密度考察結(jié)果

2.5.4 線性關(guān)系考察 按照上述規(guī)定的方法，將牛蒡子苷對(duì)照品溶液，精密稀釋成系列濃度，注入液相色譜儀，測(cè)定，以牛蒡子苷色譜峰峰面積（Y），對(duì)進(jìn)樣量（X）直線回歸，得回歸方程Y =1279543.1X+28914.3 ( r=0.9999，n=6)。結(jié)果見表3。

表3 牛蒡子苷線性關(guān)系考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，線性范圍為0.29888μg～3.7360μg。2.5.5 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)羚羊感冒顆粒樣品（060101）6份，按上述規(guī)定的方法，將供試品溶液平行制備6份，分別進(jìn)樣10μL，同時(shí)取對(duì)照品溶液(0.03976 mL.min-1) 10μl進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定牛蒡子苷含量并計(jì)算RSD，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明：6次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的RSD為1.88%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 回收率考察 精密稱取已知牛蒡子苷含量的樣品（批號(hào)060101，牛蒡子苷含量1.76 mg.g-1）6份，按1：1等度進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，按上述規(guī)定的方法操作，測(cè)定牛蒡子苷峰面積并計(jì)算加樣回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 牛蒡子苷加樣回收率考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.5.7 不同批次樣品含量測(cè)定與含量限度的制定 按上述規(guī)定的方法，共測(cè)定了七批羚羊感冒顆粒樣品中的牛蒡子苷含量。（見圖3、圖4）結(jié)果見表6。

表6 羚羊感冒顆粒樣品含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定上述7批樣品含量測(cè)定結(jié)果，暫將含量限度定為每1g含牛蒡子以牛蒡子苷(C27H34O11)計(jì)，不得少于1.00mg，即每1袋含牛蒡子以牛蒡子苷(C27H34O11)計(jì)，不得少于6.0mg。

圖3 牛蒡子苷對(duì)照品HPLC圖譜

圖4 羚羊感冒顆粒HPLC圖譜 （060101）

3 討論

在前處理方法選擇時(shí)，考察了甲醇、50%甲醇和乙醇對(duì)提取效果的影響，結(jié)果乙醇提取效果較差，甲醇和50%甲醇提取效果相當(dāng)，故選50%甲醇為提取溶劑；超聲處理和加熱回流提取效果相當(dāng)，為了方法簡(jiǎn)單，故選超聲提取方法；超聲時(shí)間對(duì)提取效果無顯著影響，為了節(jié)約時(shí)間，故確定超聲時(shí)間為30min。

用本法測(cè)定羚羊感冒顆粒中牛蒡苷的含量，方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，對(duì)本品中的易揮發(fā)成分進(jìn)行定量控制，能有效的保證本品的質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 萬德光.《中藥品種品質(zhì)與藥效》[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2007.

[3] 沙世炎.中草藥有效成分分析法 上冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982.