黃芩體外抑菌作用的初步研究

王秋菊 楊建省 重慶市云陽縣畜牧獸醫(yī)局 404500

鴨疫里默氏桿菌病 （Riemerrela anatipestifer，RA）又稱鴨傳染性漿膜炎 （infectious serositis in duckings），是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的傳染病之一[1]。目前國際上已經(jīng)確定的血清型有21型，在美國以Ⅰ、Ⅱ、ⅹ為主，在對我國京、滬、川等地區(qū)的鴨疫里默氏桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，我國以Ⅰ和Ⅱ型為主[2]。鴨疫里默氏桿菌是主要侵害家鴨、火雞和鳥類的一種接觸性傳染病，主要侵害2-7周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥。臨床上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭頸歪斜等癥狀。

目前藥物治療仍然是控制鴨疫里默氏桿菌病的首選方法，由于抗生素的濫用，使細(xì)菌菌株的耐藥性增強(qiáng)，很多藥物的療效降低。中草藥是天然性藥物，無毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性，因此引起了廣泛的關(guān)注。有研究表明，100%黃芩浸出液濾紙片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌都有明顯的抑菌作用[3]。目前對RA感染治療的報(bào)道很多，但是對中藥治療的報(bào)道較少。為此，本文研究了黃芩對RA的生長及抗生素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，探討黃芩的體外抗菌作用機(jī)理，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備

高速臺式離心機(jī)（TGL-16B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；

恒溫培養(yǎng)箱（GHX-90808-1）：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子分析天平（AR1140/C）：上海奧豪斯公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（S2-93）：上海亞榮生化儀器廠；

超凈工作臺（SW-GJ-ZFD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 主要試劑

黃芩、抗生素紙藥片、蛋白胨（Tryptone）、酵母粉（Yeast Extract）、瓊脂。

1.3 主要的菌株

鴨疫里默氏桿菌菌株：西南大學(xué)榮昌校區(qū)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 藥液的制備

將黃芩粉碎，稱重后加入8倍蒸餾水浸泡后煎煮，30min/次，煎煮2次，合并兩次的煎煮液，離心去除掉液體里的藥物殘?jiān)眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀在75℃下蒸餾濃縮，濃縮后每毫升藥液含1g生藥。藥液分裝，高壓滅菌20min，置于4℃冰箱中備用。

1.5 黃芩對RA最低抑菌濃度（MIC）的測定

（1）菌液的制備

取RA菌種劃線接種于普通瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢合格后，挑去單個菌落接種于5mL肉湯培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用滅菌的肉湯培養(yǎng)基稀釋調(diào)整濃度在1×103CFU/mL。

(2)最低抑菌濃度的測定

采用5倍稀釋法測定。取8支滅菌的試管，無菌濃度下分別加入濃度為1×103CFU/mL的菌液4mL/支，分別編號 1，2，3，4，5，6，7，8；取 1mL 藥液加入第1號滅菌的試管，混勻，然后吸取1mL加入到第2支試管，如此依次稀釋到第7支試管，第8支試管不加藥液作為對照；另取一支試管做不加菌液只有藥物的對照。37℃下震蕩培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)菌生長情況，并測定培養(yǎng)前與培養(yǎng)后OD600值，以與對照組無顯著差異管的最高稀釋度作為黃芩對RA的MIC。

1.6 黃芩對RA耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

按1：100的比例將一定量的RA純培養(yǎng)物接種于5mL濃度為0.3MIC的普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃、170rpm/min下震蕩培養(yǎng)過夜，記為第1代。再將第1代培養(yǎng)物按1：100的比例接種于5 mL濃度為0.3MIC的普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180rpm/min下震蕩培養(yǎng)過夜，記為第2代。按照此方法連續(xù)培養(yǎng)至20代，并注意觀察細(xì)菌的生長情況。取第20代培養(yǎng)物，采用1.5方法測定黃芩的最低抑菌濃度，比較與原代之間的差別，同時設(shè)立不含黃芩藥液的空白對照和pH值與試驗(yàn)組一致的陰性對照。

1.7 黃芩對RA抗生素耐受性的逆轉(zhuǎn)作用

取1.6RA原代和第20代純培養(yǎng)物，采用藥敏紙片法，測定對四環(huán)素 （Tetracucline）、卡那霉素（Kalamycin）、 強(qiáng)力霉素 （Doxycycline）、 新霉素（Neomycin）、 阿 莫西林 （Amoxicillin）、 鏈 霉 素（Streptomycin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）和氟哌酸（Norfloxacin）的敏感性，測定抑菌圈大小，比較兩代培養(yǎng)物之間的差異。

表1：黃芩對RA菌株的最低抑菌濃度

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 黃芩對RA菌株最低抑菌濃度的測定

用5倍稀釋法測定梯度稀釋，測定黃芩對RA菌株的最低抑菌濃度。菌液初始濃度為1×103CFU/mL，以與對照組無明顯差異管的最高稀釋度作為黃芩對RA的MIC。試驗(yàn)結(jié)果顯示,黃芩對RA菌株的MIC為1.6mg/mL,見表1。

2.2 黃芩對RA的耐藥性誘導(dǎo)作用

將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代，測定黃芩對RA第20代的MIC，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃芩濃度為1.6mg/mL時，RA生長情況與空白對照組的差異很小，即黃芩對第20代RA的MIC為1.6mg/mL。

表2：黃芩對RA菌株耐藥性的誘導(dǎo)作用

2.3 黃芩對RA抗生素耐受性的逆轉(zhuǎn)作用

將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代，采用藥敏制片法分別測定原代和第20代純培養(yǎng)物對抗生素的敏感性，經(jīng)游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的大小，兩代次的比較結(jié)果見表3。研究結(jié)果顯示：RA對四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星的敏感性并未發(fā)生顯著的變化，對強(qiáng)力霉素、阿莫西林、鏈霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性發(fā)生了顯著性的變化。研究結(jié)果表明，經(jīng)過傳代后的RA對抗菌藥物的敏感性增強(qiáng)。

3 分析與討論

3.1 黃芩對RA菌株的耐藥性誘導(dǎo)作用

研究發(fā)現(xiàn)，RA在含有低濃度黃芩的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，MIC無變化，說明RA對黃芩不容易產(chǎn)生耐藥性。

3.2 黃芩對RA抗生素耐受性逆轉(zhuǎn)作用

本研究發(fā)現(xiàn)，將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代，采用藥敏制片法分別測定原代和第20代純培養(yǎng)物對抗生素的敏感性，結(jié)果顯示：RA對四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星的敏感性并未發(fā)生顯著的變化，對強(qiáng)力霉素、阿莫西林、鏈霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性發(fā)生了顯著性的變化。研究結(jié)果表明，經(jīng)過傳代后的RA對抗菌藥物的敏感性增強(qiáng)。病原菌對抗生素產(chǎn)生耐受性主要是通過基因水平或者是蛋白質(zhì)水平實(shí)現(xiàn)的，而重要對病原菌抗生素耐受性的逆轉(zhuǎn)作用也就是通過這兩個水平實(shí)現(xiàn)的，且對不同藥物耐受性的逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)度不同。重要對病原菌抗生素耐受性產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用的可能機(jī)制主要包括：

表3：黃芩對RA菌株抗生素耐受性的逆轉(zhuǎn)作用

（1）破壞RA菌體細(xì)胞的莢膜多糖成分，藥物與細(xì)菌發(fā)生直接接觸，從而使菌體細(xì)胞對黃芩的敏感性增強(qiáng)；（2）一直細(xì)菌DNA、RNA、蛋白質(zhì)的生物合成或者阻斷菌體細(xì)胞的訊號通路，影響RA菌體細(xì)胞的正常生理活動。本研究中RA經(jīng)連續(xù)傳代后對部分抗生素的敏感性增強(qiáng)，其確切的原因有待進(jìn)一步的深入研究。

[1]卡爾尼克BW（高福,劉文軍主譯）.禽病學(xué)（第九版）[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1991.

[2]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.

[3]劉云波,郭立華,邱世翠,等.黃芩體外抑菌作用研究[J],時珍國醫(yī)國藥.2002,13(10):596.