小菜蛾魚尼丁受體基因克隆及序列分析

孫麗娜， 芮昌輝， 袁會(huì)珠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

魚尼丁受體（RyR）是目前所知最大的鈣離子通道，由4個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基的分子量約為560ku。在脊椎動(dòng)物中存在3種亞型RyRs，而在昆蟲中僅存在一種魚尼丁受體［1]。二酰胺類化合物氟蟲雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對鱗翅目害蟲具有較高的活性，其作用機(jī)制與其他類殺蟲劑不同，它們可以結(jié)合昆蟲體內(nèi)的魚尼丁受體，抑制昆蟲取食，引起蟲體收縮，使蟲體變粗變短，最終導(dǎo)致死亡［2－3]。自兩個(gè)化合物創(chuàng)制成功以來，不僅作用于魚尼丁受體化合物的合成備受關(guān)注，昆蟲魚尼丁受體的基因克隆及分子特性也因此成為焦點(diǎn)［4－5]。

小菜蛾［Plutella xylostella（L.）]是一種為害十字花科植物的世界性害蟲，也是對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的最嚴(yán)重害蟲之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，小菜蛾已經(jīng)對70多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類，以及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和蘇云金桿菌（Bt）等殺蟲劑［6]。盡管二酰胺類化合物對小菜蛾具有較高的活性，但是有研究稱小菜蛾對其抗性產(chǎn)生較快。田間監(jiān)測表明，在我國華南地區(qū)田間小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性與室內(nèi)敏感小菜蛾相比已達(dá)到100多倍［7]；而在泰國，2008年至2011年間，小菜蛾對氟蟲酰胺的抗性從1.5倍增至4 817倍，對氯蟲苯甲酰胺的抗性從35.4倍增至152倍［8]。因此克隆小菜蛾魚尼丁受體基因可以為今后小菜蛾抗性機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

小菜蛾于室內(nèi)采用無藥劑接觸甘藍(lán)苗連續(xù)飼養(yǎng)的技術(shù)飼養(yǎng)［9]。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取3齡小菜蛾幼蟲，用液氮研磨后，參照Trizol（Invitrogen）試劑說明書步驟提取總RNA。以反轉(zhuǎn)錄酶（PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，大連，中國）合成cDNA第一鏈；利用TaKaRa 3′和5′RACE 試劑盒合成3′和5′RACE cDNA第一鏈。

1.3 引物設(shè)計(jì)

如圖1所示，小菜蛾RyR序列可以由18個(gè)片段重疊組合得到。本試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)根據(jù)美國國家生物工程信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中家蠶B.m.（Bombyx mori）、煙芽夜蛾 H.v.（Heliothis virescens）、黑腹果蠅D.m.（Drosophila melanogaster）、桃蚜 M.p.（Myzus persicae）、棉蚜A.g.（Aphis gossypii）、玉米飛虱P.m.（Peregrinus maidis）、埃及伊蚊A.a（Aedes aegypti）這個(gè)7個(gè)物種魚尼丁受體基因氨基酸中保守序列來設(shè)計(jì)簡并引物。根據(jù)簡并引物的PCR測序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，引物見表1。所有引物的合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

圖1 PCR擴(kuò)增和克隆小菜蛾魚尼丁受體（Px－RyR）cDNA片段示意圖

表1 克隆小菜蛾魚尼丁受體基因的引物1）

1.4 PCR擴(kuò)增

片段S1～S19的擴(kuò)增，按照TaKaRa Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行，按照不同的引物及擴(kuò)增片段的長度設(shè)置不同的PCR反應(yīng)程序。

cDNA 3′末端快速擴(kuò)增（3′RACE），outer PCR和inner PCR的反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃30s，65℃→50℃（－0.5℃／循環(huán)）30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；94℃30s，50℃30s，72℃1min，15個(gè)循環(huán)，72℃10min。

cDNA 5′末端快速擴(kuò)增（5′RACE），outer PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。Inner PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，68℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

將目的片段克隆于pMD?19－T Simple Vector載體內(nèi)，選取陽性克隆測序。序列測定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.5 序列測定及分析

利用DNAstar和Mega5.0等軟件進(jìn)行序列分析和比較。利用美國國家生物工程信息中心（NCBI，http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）的BLAST網(wǎng)絡(luò)工具與GenBank中的其他物種序列進(jìn)行比較，確定目標(biāo)產(chǎn)物的真實(shí)可靠性。分子量和等電點(diǎn)（molecular weight／isoelectric point）MW／pI在ExPaSy website（http：∥us.expasy.org／tools／pitool.htm）預(yù)測計(jì)算。跨膜區(qū)域預(yù)測可以于www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM 進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)二級 結(jié) 構(gòu) 于 http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi和http：∥www.expasy.org／tools／scanprosite／分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)NCBI中昆蟲魚尼丁受體基因序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過RT－PCR擴(kuò)增得到了目標(biāo)片段，而后根據(jù)目的片段序列，再設(shè)計(jì)特異性引物，繼續(xù)進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。進(jìn)一步進(jìn)行5′RACE和3′RACE擴(kuò)增，得到兩端序列后，通過小菜蛾所有片段的序列拼接得到小菜蛾魚尼丁受體基因cDNA序列全長。小菜蛾魚尼丁受體基因全長為15 748bp，其中5′端非閱讀區(qū)267bp，3′端非閱讀區(qū)109bp，開放閱讀區(qū)15 372bp。開放閱讀區(qū)編碼5 123個(gè)氨基酸殘基（GenBank登錄號為JF927788），預(yù)測其分子量約為579.39ku，等電點(diǎn)為5.45。

對預(yù)測的Px－RyR氨基酸序列與其他物種RyR基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明Px－RyR與其他物種RyR存在很高的同源性如表2。與煙芽夜蛾（H.v.）、家蠶（B.m.）、桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）、鼠（M.m.）骨骼肌RyR1、鼠心肌RyR2及鼠RyR3的相似性分別為92%、92%，77%、77%、80%、78%、45%、47%、46%。

表2 Px－RyR與其他物種RyRs序列相似性 %

通過MEGA 5.0利用鄰接法對22個(gè)物種RyR蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)化樹分析（Bootsrap為1 000個(gè)重復(fù)），從而通過RyR氨基酸多態(tài)性來揭示這些物種間RyR蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系。由圖2看出，22個(gè)物種間的RyR基本分兩大類，即脊椎動(dòng)物中一類，無脊椎動(dòng)物中一類。圖2可以明顯看出，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾和家蠶RyR關(guān)系最近。

圖2 Px－RyR與其他21個(gè)物種間RyR蛋白質(zhì)進(jìn)化樹分析

根據(jù)氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測小菜蛾魚尼丁受體基因存在6個(gè)跨膜區(qū)域，位于第4 474～5 022氨基酸之間。這6個(gè)氨基酸序列分別為（如表3）：Phe4474－Leu4496；Asp4655－Tyr4676；Val4734－Leu4756；Phe4875－Ala4897；Leu4923－Phe4945；Ile5003－Ile5022。除了跨膜區(qū)域外，小菜蛾魚尼丁受體蛋白還存在其他結(jié)構(gòu)域。如RyR結(jié)構(gòu)域（重復(fù)序列）、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放通道結(jié)構(gòu)域、鈣離子結(jié)合的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域、MIR結(jié)構(gòu)域（因該結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于甘露糖轉(zhuǎn)移酶、三磷酸肌醇受體和魚尼丁受體中而命名）、Spla／RYanodine receptor SPRY結(jié)構(gòu)域、離子通道結(jié)構(gòu)域、魚尼丁受體和三磷酸肌醇受體相似結(jié)構(gòu)域、似SPRY結(jié)構(gòu)域及一些未命名的結(jié)構(gòu)域［10]。

表3 小菜蛾RyR跨膜區(qū)域序列

3 結(jié)論與討論

魚尼丁受體是最大的鈣離子釋放通道之一，在肌肉興奮收縮偶聯(lián)中具有重要作用，在很多細(xì)胞中具有第二信使的作用。魚尼丁受體因其所具有的特性，近30年來在醫(yī)學(xué)界備受關(guān)注，而近10年來在殺蟲劑研究領(lǐng)域也深受廣大研究者關(guān)注［1]。因此克隆昆蟲魚尼丁受體基因?qū)ψ饔糜隰~尼丁受體新化合物的設(shè)計(jì)及害蟲抗藥性研究至關(guān)重要。在本研究中，筆者克隆了小菜蛾魚尼丁受體。但其具有較大分子量，不易表達(dá)。

Puente等［11]克隆了編碼煙芽夜蛾RyR C－末端1 172個(gè)氨基酸，通過比對發(fā)現(xiàn)其與哺乳動(dòng)物3種亞型的RyRs具有45%～47%的同源性，與桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）的同源性分別為76.8%、77.5%、79.6%、78.2%。而本文中小菜蛾RyR基因與其他物種同源性關(guān)系分析表明，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾RyR和蠶相似性高達(dá)92%，這與3種昆蟲同屬鱗翅目有關(guān)。

根據(jù)預(yù)測的氨基酸二級結(jié)構(gòu)分析，小菜蛾魚尼丁受體基因C端存在6個(gè)跨膜區(qū)域，這也是魚尼丁受體基因的特性之一。有研究認(rèn)為魚尼丁受體基因存在6～8個(gè)跨膜區(qū)域，也有研究認(rèn)為存在4～12個(gè)跨膜區(qū)域［12－14]，然而魚尼丁受體基因跨膜區(qū)域的特定結(jié)構(gòu)尚未明確。Puente等［11]研究表明煙芽夜蛾C－末端存在5個(gè)較高的疏水性區(qū)域，這5個(gè)區(qū)域在氨基酸序列的位置為：516～532（M′）、704～720（M1）、782～798（M2）、972～988（M3）和1 054～1 070（M4），即為5個(gè)跨膜區(qū)域。煙芽夜蛾RyR與小菜蛾RyR跨膜區(qū)域的不同，可能是由于計(jì)算方式不同引起的。小菜蛾RyR基因6個(gè)跨膜區(qū)的親水性指數(shù)為1.5～2.6，然而TM4的親水性指數(shù)僅0.6，這與Zorzato等［14]推測的12個(gè)跨膜區(qū)域的親水性指數(shù)在0.8～2.9之間基本一致。

Puente等［11]研究還表明在煙芽夜蛾RyR跨膜區(qū)M3和M4之間存在一個(gè)鈣離子釋放通道的成孔結(jié)構(gòu)域GVRAGGGIGD，同樣的結(jié)構(gòu)域也存在于小菜蛾RyR基因C－末端的TM5和TM6之間。然而在兔心肌RyR中也存在這個(gè)結(jié)構(gòu)，但是GXRXGGG－XGD第8個(gè)氨基酸殘基I在兔心肌RyR中為第4897個(gè)氨基酸 T［15]。

此外，一個(gè)重復(fù)序列出現(xiàn)4次不僅體現(xiàn)在小菜蛾魚尼丁受體基因中，也存在于脊椎動(dòng)物的骨骼肌和心肌魚尼丁受體中［14－15]。第一個(gè)重復(fù)區(qū)域有94個(gè)殘基，位于859～952氨基酸之間；第二和第三個(gè)重復(fù)區(qū)域均有95個(gè)氨基酸殘基，位于972～1 066和2 838～2 932氨基酸之間；第四個(gè)重復(fù)區(qū)域有89個(gè)氨基酸，位于2 964～3 052氨基酸之間。比對重復(fù)序列（如圖3），根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，小菜蛾魚尼丁受體基因的重復(fù)序列是α－α型，而在RyR1和RyR2的重復(fù)序列呈現(xiàn)的是β－α－β－α型。在小菜蛾魚尼丁受體基因中4個(gè)重復(fù)序列的相似性有33%，在哺乳動(dòng)物RyR1和RyR2中重復(fù)序列的相似性為28%，然而這一區(qū)域的功能尚未得到驗(yàn)證。

微摩爾濃度的細(xì)胞質(zhì)Ca2＋可以激活RyRs，毫摩爾的Ca2＋可以抑制RyRs。這些雙向作用可能是由不同親和性的Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)的相互作用引起。在鱗翅目昆蟲的RyRs中存在PPPEPTEEE氨基酸束，而在兔RyR1這也存在一個(gè)脯氨酸和谷氨酸豐富的氨基酸束PEPEPEPEPEPE（4 488～4 499）［16]。45Ca2＋的平衡結(jié)合試驗(yàn)表明龍蝦 RyR與哺乳動(dòng)物RyR1和RyR2的相應(yīng)此結(jié)構(gòu)域包含了Ca2＋鈍化RyR的結(jié)合位點(diǎn)即位于EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域鈣離子結(jié)合位點(diǎn)［17]。

圖3 重復(fù)序列比對結(jié)果圖

ATP與RyR1存在3個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列為GXGXXG［18]。在煙芽夜蛾的RyR中3個(gè)位點(diǎn)分別為GVGLEG、GEGGEG、GSGESG。而小菜蛾中僅有1個(gè)相似位點(diǎn)位于RyR的4 005～4 010（GVGLEG）。此外與煙芽夜蛾其余兩個(gè)位點(diǎn)的位置，小菜蛾的氨基酸序列分別為4 683～4 688（AEPGEG），4 710～4 715（GSGEE－）。在后兩個(gè)位點(diǎn)區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)突變位點(diǎn)，一個(gè)缺失位點(diǎn)，可能是由于物種間的差異造成，或者是ATP與小菜蛾RyR就存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

另一個(gè)對哺乳動(dòng)物RyRs具有重要調(diào)節(jié)作用的是具有雙向功能的鈣調(diào)蛋白。脫鈣鈣調(diào)蛋白（Ca2＋游離鈣調(diào)蛋白）激活的同時(shí)，鈣調(diào)蛋白（Ca2＋結(jié)合鈣調(diào)蛋白）抑制RyR鈣離子通道［19]。根據(jù)有關(guān)研究推斷4124HS RLWDAVGGFLFLFSHMQDKLSKH4148可能是鈣調(diào)蛋白與RyR的結(jié)合位點(diǎn)［11]。

Ulich等［20]認(rèn)為氟蟲雙酰胺與RyR的結(jié)合不受魚尼丁的影響，Kenta等［21]研究表明，氟蟲雙酰胺與鱗翅目昆蟲RyR的結(jié)合位點(diǎn)在C－末端4 111～5 084氨基酸之間，因此推測氟蟲雙酰胺與RyR的結(jié)合位點(diǎn)不同于魚尼丁的結(jié)合位點(diǎn)?？梢?，有關(guān)二酰胺類殺蟲劑的作用位點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。因此小菜蛾魚尼丁受體基因的克隆為此提供了有利的研究基礎(chǔ)，也為今后小菜蛾對二酰胺類化合物產(chǎn)生的抗性研究提供理論支持。

［1]David B S，Daniel C，Timothy R C.Insect ryanodine receptors：molecular targets for novel pest control chemicals［J].In－vertebrate Neuroscience，2008，8（3）：107－119.

［2]Greg T H，Melissa Z，Paula G M.Feeding cessation effects of chlorantraniliprole，a new anthranilic diamide insecticide，in comparison with several insecticides in distinct chemical classes and mode－of－action groups［J].Pest Management Science，2009，65：969－974.

［3]Hirooka T，Nishimatsu T，Kodama H，et al.The biological profile of flubendiamide，a new benzenedicarboxamide insecticide［J].Pflanzenschutz－Nachrichten Bayer，2007，60：183－202.

［4]Ralf N.Insecticide mode of action：return of the ryanodine receptor［J].Pest Management Science，2006，62：690－692.

［5]Timothy C，Daniel C，Steven G，et al.Isolation and use of ryanodine receptor：US 7655395［P].2010－02－02.

［6]Sun Jingyan，Liang Pei，Gao Xiwu.Cross－resistance patterns and fitness in fufenozide－resistant diamondback moth，Plutella xylostella（Lepidoptera：Plutellidae）［J].Pest Management Science，2012，68（2）：285－289.

［7]Wang Xinling，Li Xiangyong，Shen Aidong，et al.Baseline susceptibility of the diamondback moth（Lepidoptera：Plutellidae）to chlorantraniliprole in China［J].Journal of Economic Entomology，2010，103：843－848.

［8]Sukonthabhirom S，Dumrongsak D，Jumroon S，et al.Update on DBM diamide resistance from Thailand：causal factors and learnings［DB／OL].（2011－3－25）［2011－08－10].http：∥www.irac－online.org／resources－2／document－library／＃Posters.

［9]楊峰山.小菜蛾Bt蛋白受體基因克隆及序列分析［M].哈爾濱：黑龍江大學(xué)出版社，2009：37－40.

［10]Hamilton S L M，Serysheva I I.Ryanodine receptor structure：progress and challenges［J].The Journal of Biological Chemistry，2009，284（7）：4047－4051.

［11]Puente E，Suner M，Evans A D，et al.Identification of a polymorphic ryanodine receptor gene from Heliothis virescens（Lepidoptera：Noctuidae）［J].Insect Biochemistry and Molec－ular Biology，2000，30：335－347.

［12]Guoguang D，Bimal S，Vijay K K，et al.Topology of the Ca2＋release channel of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum（RyR1）［J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2002，99：16725－16730.

［13]Hiroshi T，Seiichiro N，Takeshi M，et al.Primary structure and expression from complementary DNA of skeletal muscle ryanodine receptor［J].Nature，1989，339：439－445.

［14]Francesco Z，Junichi F，Kinaya O，et al.Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms of the Ca2＋release channel（ryanodine receptor）of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum［J].The Journal of Biological Chemistry，1990，265：2244－2256.

［15]Kinya O，Huntington F W，Vijiay K K，et al.Molecular cloning of cDNA encoding the Ca2＋release channel（ryanodine receptor）of rabbit cardiac muscle sarcoplasmic reticulum［J].The Journal of Biological Chemistry，1990，265：13472－13483.

［16]Wayne S R C，Lin Z，David H M.Antibodies as probes for calcium activation sites in the calcium release channel ryanodine receptor of rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum［J].The Journal of Biological Chemistry，1993，268：13414－13421.

［17]Xiong Hui，F(xiàn)eng Xiaoyong，Gao Ling，et al.Identification of a two EF－h(huán)and Ca2＋binding domain in lobster skeletal muscle ryanodine receptor／Ca2＋release channel［J].Biochemistry，1998，37：4804－4814.

［18]Rik K W，Wim G J H.Predicted nucleotide－binding properties of p21protein and its cancer－associated variant［J].Nature，1983，302：842－844.

［19]Ashutoshe T，Le X，Geoffrey M，et al.Calmodulin activation and inhibition of skeletal muscle Ca2＋release channel（ryanodine receptor）［J].Biophysical Journal，1995，69：106－119.

［20]Ulich E K，Peter L，Nicole L，et al.Phthalic acid diamides activate ryanodine sensitive Ca2＋release channels in insects［J].Cell Calcium，2006，39：21－33.

［21]Kenta K，Shigeki K，Yuichi S，et al.Molecular characterization of flubendiamide sensitivity in the lepidopterous ryanodine receptor Ca2＋release channel［J].Biochemistry，2009，48：10342－10352.