基于CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)的高靈敏、快速細(xì)菌計數(shù)新方法的研究*

傅 昕，張 何，胡家義，石 敏

(湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭411104)

細(xì)菌是單細(xì)胞微生物的主要類群之一，是所有生物中數(shù)量最多的一類。其中一些細(xì)菌屬于病原體，能引起感染性疾病，比如霍亂、梅毒、炭疽病、尿道炎、膀胱炎和痢疾等。細(xì)菌(尤其是病原菌)的檢測涉及到食品安全檢驗(yàn)、疾病診斷以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，與人類健康和社會安定息息相關(guān)。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測方法(如比濁法和平板計數(shù)方法)靈敏度低、費(fèi)時耗力，不能滿足當(dāng)前食品安全快速檢測的要求。近年來，報道了一些的細(xì)菌計數(shù)的新方法，包括酶聯(lián)免疫法 (ELISA)[1]、PCR 法[2]和流式細(xì)胞計數(shù)法[3]，這些新方法雖然縮短了檢測時間、增強(qiáng)了檢測信號，但是檢測儀器昂貴、并且檢測前需預(yù)先富集[4]。目前，熒光檢測方法有效地克服了這些缺點(diǎn)，更有利于快速、簡單、有效的對原始樣品直接進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)[5－8]。然而，現(xiàn)有的熒光檢測法一般以有機(jī)熒光染料作為熒光標(biāo)記物，因此還是存在許多不足之處。

與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜對稱、半峰寬窄(20 nm～30 nm)，發(fā)射波長可調(diào)(400 nm到2 μm不等)等特點(diǎn)。另外量子點(diǎn)為多電子體系，熒光效率高于單個分子，且光化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，不易分解，不易漂白，在某些情況下其發(fā)光時間可達(dá)染料分子的100倍。早在1998年Alivisatos[9]等及Nie等[10]首次報道將QDs應(yīng)用于細(xì)胞熒光標(biāo)記、成像等方面的研究，隨著對QDs研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍由最初的生物學(xué)擴(kuò)展到醫(yī)藥學(xué)、食品、環(huán)境保護(hù)等多個領(lǐng)域[11－14]。裸量子點(diǎn)顆粒(如 CdSe)易受雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，其量子產(chǎn)率很低，化學(xué)家們經(jīng)過多年努力，通過在核表面覆蓋另一層晶體結(jié)構(gòu)相似、帶隙更大的半導(dǎo)體材料(如ZnS)，使量子點(diǎn)表面無輻射重組位置被鈍化、減少激發(fā)缺陷，且能有效限制對核的激發(fā)，消除非輻射弛豫，使熒光量子產(chǎn)率和光熱穩(wěn)定性都得到了大大的提高[15－18]。因此，核殼型量子點(diǎn)是一種更理想的熒光標(biāo)記物。目前為止，雖然已經(jīng)有一些用量子點(diǎn)標(biāo)記抗原和酶來快速、特異性的檢測病原體細(xì)菌的報道，但是用核殼型量子點(diǎn)來進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)的研究還非常少。

本文以乙酰丙酮鎘和硬脂酸鋅作為前驅(qū)體合成了單分散性的、熒光效率高的核殼型量子點(diǎn)，并充分利用核殼型量子點(diǎn)優(yōu)良的光學(xué)性能，以EDC/NHS作為交聯(lián)劑，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(S.aureus)作為檢測目標(biāo)，建立了一種高靈敏的、簡單快速的細(xì)菌計數(shù)新方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，體系的相對熒光強(qiáng)度隨細(xì)菌數(shù)量的增加而增大，線性范圍為102CFU/mL～106CFU/mL(跨越4個數(shù)量級)，檢測限為102CFU/mL。此外，該方法操作簡單，不需要昂貴的試劑和儀器，檢測時間短(1 h～2 h)。我們還對5種實(shí)際樣品進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)量測定，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.6% ～8.1%之間。由此可見，基于CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)的熒光標(biāo)記技術(shù)，為細(xì)菌的快速、靈敏的定量檢測提供了新的契機(jī)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

F－2500型熒光分光光度計(日本日立公司);JEOL JEM－1230型透射電鏡TEM(Transmission E-lectron Microscopy;日本電子株式會社);PHS－25型酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司);SHZ－82水浴恒溫振蕩器(金壇市文華科教實(shí)驗(yàn)儀器廠);Zeiss熒光倒置顯微鏡(Zeiss Axio Observer Z1);QYC－200全溫培養(yǎng)搖床(上海?，敼?;TD4A型臺式離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司)。

1.2 試劑

三辛基氧化膦(TOPO，90%)，三辛基膦(TOP，98%)，十六烷基胺(HDA，90%)，1，2－十六烷二醇(90%)，乙酰丙酮鎘(＞99.9%)，硬脂酸鋅(95%)，3－巰基丙酸(MPA，＞99.0%)，1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，＞98%)，N－羥基琥珀酰亞胺(NHS，＞98%)，Se粉(＞99.5%)，硫粉(99.5%)均購買于 Sigma-Aldrich Chemical Co。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)的合成

CdSe核的制備 參照并改進(jìn)文獻(xiàn)[19]方法，在N2保護(hù)下，將11.84 mg硒粉溶入2.5 mL TOP 中，得到Se的前驅(qū)體溶液(TOPSe);將0.310 6 g乙酰丙酮鎘和0.568 g 1，2－十六烷二醇溶解于3 mL TOP中，制得Cd前驅(qū)體溶液;然后往三頸燒瓶中依次加入3.125 g TOPO、2.875 g HDA 以及 1.7 mL TOP，緩慢加熱到360℃，將Cd、Se前驅(qū)體溶液快速加入，并調(diào)節(jié)溫度至300℃，直到獲得所需波長的量子點(diǎn)。

CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)的制備[20]氮?dú)獗Ｗo(hù)下，0.316 g硬脂酸鋅溶于2.5 mL甲苯中，得 Zn前驅(qū)體溶液;16 mg的S粉溶于2.5 mL TOP中，得S前驅(qū)體溶液;向三頸燒瓶中加入20 mg CdSe、4 mL正庚烷、2.5 g TOPO和1.5 g HDA?；旌先芤杭訜嶂?90℃，然后把Zn、S的前驅(qū)體溶液緩慢加入反應(yīng)器中，保持溫度在190℃ ～200℃反應(yīng)1 h，即得CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)。

最后將20 mg CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)溶于1.0 mL 氯仿中，加入 100 μL 0.1 mol/L 的巰基丙酸，攪拌過夜。洗滌干燥后即得水溶性的巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)(MPA-CdSe/ZnS core/shell QDs)[21]。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌株是由中南大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室提供。把金黃色葡萄球菌用LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基，在37℃中恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)出的細(xì)菌數(shù)量通過平板計數(shù)法可以獲得。細(xì)菌通過無菌的PBS(pH 7.4)溶液離心洗滌，最后在PBS溶液中保存。

1.3.3 MPA-CdSe/ZnS 與細(xì)菌的結(jié)合過程

MPA-CdSe/ZnS與金黃色葡萄球菌結(jié)合用EDC和NHS作為交聯(lián)劑。為了測試量子點(diǎn)與細(xì)菌結(jié)合的最佳條件，我們先將100 μL 1 mg/mL的EDC加入200 μL不同濃度的MPA-CdSe/ZnS量子點(diǎn)中，攪拌15 min。再加入100 μL 0.15 mg/mL 的 NHS，反應(yīng)20 min。EDC與量子點(diǎn)表面的羧基發(fā)生反應(yīng)，形成有活性的中間體，NHS能在水溶液中穩(wěn)定此中間體[22－23]。最后與細(xì)菌在37 ℃孵育10 min ～70 min?；旌先芤和ㄟ^0.22 μm超濾膜純化，除去過量的量子點(diǎn)。同時我們將不加EDC/NHS的反應(yīng)體系做為對照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdSe/ZnS量子點(diǎn)的性能表征

2.1.1 CdSe/ZnS QDs熒光光譜圖

量子點(diǎn)作為一種半導(dǎo)體納米晶體，粒徑不同時會產(chǎn)生不同顏色的熒光。取適量的產(chǎn)物溶液，用F－2500型熒光分光光度計對其進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測定。圖1(a)為不同反應(yīng)時間(30 s，30 min和2 h)取樣所得到的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜圖，從圖中可以看出，所制備的量子點(diǎn)峰型窄而對稱，半峰寬均在30 nm左右，沒有拖尾現(xiàn)象，說明其尺寸分布較窄。根據(jù)納米粒子的尺寸D與其熒光峰 λe之間的關(guān)系[24]:。以此計算以上 3個反應(yīng)時間制得的樣品(發(fā)射波長分別為520 nm、570 nm、615 nm)的粒徑分別為 3.0 nm、3.3 nm、4.9 nm。插圖為反應(yīng)2 h后所得的核殼型量子點(diǎn)的透射電鏡圖。由圖可以看到，量子點(diǎn)大小為5 nm左右，形狀呈類球型，并且分布均勻，很少團(tuán)聚，具有良好的單分散性和均一性。該透射電鏡(TEM)表征與粒徑計算結(jié)果互為佐證。

圖1

2.1.2 CdSe/ZnS QDs熒光穩(wěn)定性考察

我們還將CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)與異硫氰酸熒光素(FITC)和德克薩斯紅(Texas Red)兩種熒光染料的抗光漂白性能進(jìn)行了比較。我們采用F－2500型熒光分光光度計進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定，連續(xù)掃描60 min，并實(shí)時觀察其熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明CdSe/ZnS抗光漂白性大大優(yōu)于熒光染料。FITC和Texas Red的熒光強(qiáng)度在15 min時已經(jīng)減低了15%，在30 min時已經(jīng)基本消失，而CdSe/ZnS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度在60 min時基本維持不變(圖1(b))。此外，進(jìn)一步考察了放置時間對于其穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，室溫下放置5個月以后，幾乎觀察不到沉降等現(xiàn)象，光譜性能依然良好，表明該量子點(diǎn)具有非常優(yōu)良的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供了保證。上述性能表征結(jié)果表明，所制備的CdSe/ZnS量子點(diǎn)具有良好的光譜性能，并且大小均一，單分散性好，為接下來的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 MPA-CdSe/ZnS量子點(diǎn)檢測細(xì)菌的原理

由于巰基丙酸修飾的量子點(diǎn)表面有許多羧基基團(tuán)，EDC可以與量子點(diǎn)表面的羧基發(fā)生反應(yīng)，形成有活性的中間體，NHS在水溶液中穩(wěn)定此中間體，最后中間體與細(xì)菌表面蛋白上的氨基結(jié)合(圖2)。所以細(xì)菌的數(shù)量越多，與其結(jié)合的量子點(diǎn)也越多，體系熒光強(qiáng)度也就越大，從而可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化達(dá)到定量檢測細(xì)菌的目的。

圖2 CdSe/ZnS量子點(diǎn)檢測細(xì)菌的原理

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 量子點(diǎn)和細(xì)菌孵育時間的選擇

為了確定最佳的孵育時間，我們做了一系列條件實(shí)驗(yàn)。首先，將100 μL 1 mg/mL 的 EDC、200 μL 5.0 mg/mL MPA-CdSe/ZnS 量子點(diǎn)和100 μL 0.15 mg/mL的NHS反應(yīng)20 min。然后加入一定數(shù)量的細(xì)菌，在37℃中分別孵育10 min～70 min。圖3(a)顯示了孵育時間對體系熒光強(qiáng)度的影響。從圖中看出，體系的熒光強(qiáng)度在0～50 min內(nèi)隨時間的增長而升高，超過50 min后熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，說明50 min時反應(yīng)已經(jīng)基本完成。故本實(shí)驗(yàn)選擇孵育時間為50 min。

圖3 體系熒光強(qiáng)度所受影響

2.3.2 MPA-CdSe/ZnS QDs稀釋度的選擇

我們還考察了量子點(diǎn)稀釋度對于體系熒光強(qiáng)度的影響(圖3(b))，量子點(diǎn)的原始濃度為5.0 mg/mL。結(jié)果表明，量子點(diǎn)在1∶2～1∶32稀釋度范圍內(nèi)時，體系的熒光強(qiáng)度隨著量子點(diǎn)的稀釋度的減小(即量子點(diǎn)濃度的增大)而增大，在稀釋度為1∶2時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。因此，在以下試驗(yàn)中，選用1∶2的量子點(diǎn)稀釋度，即量子點(diǎn)濃度為2.5 mg/mL。

2.4 MPA-CdSe/ZnS與細(xì)菌結(jié)合后的熒光顯微鏡成像

為了驗(yàn)證量子點(diǎn)與細(xì)菌完全結(jié)合，我們借助熒光顯微鏡成功的進(jìn)行成像探測研究(圖4)。由圖可知，量子點(diǎn)EDC/NHS的交聯(lián)作用下，已經(jīng)成功的與S.aureus結(jié)合，細(xì)菌表面表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光(圖4(b))，進(jìn)一步證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的原理。同樣，作為平行對照實(shí)驗(yàn)，對于沒有EDC/NHS交聯(lián)劑的體系我們也進(jìn)行了熒光顯微鏡成像(圖4(c))，細(xì)菌表面觀察不到熒光信號的表達(dá)。由此我們可以得出，該方法制備的核殼型量子點(diǎn)熒光納米顆粒具有良好的特異性，為接下來的定量檢測奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

圖4 EDC/NHS存在下，量子點(diǎn)與S.aureus結(jié)合后的明視場成像(A)和熒光成像(B);(C)無EDC/NHS時，量子點(diǎn)與S.aureus結(jié)合后的熒光成像

2.5 檢測范圍和檢測限的考察

我們進(jìn)一步考察了基于MPA-CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)對細(xì)菌定量測定的線性范圍和最低檢測濃度，在最優(yōu)檢測條件下即在37℃下，S.aureus與2.5 mg/mL CdSe/ZnS QDs反應(yīng)50 min后進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，金黃色葡萄球菌總數(shù)量在102CFU/mL～108CFU/mL范圍內(nèi)時，體系的相對熒光強(qiáng)度隨細(xì)菌數(shù)量的增加而增大。且當(dāng)金黃色葡萄球菌總數(shù)量在102CFU/mL～106CFU/mL范圍時，細(xì)菌總數(shù)與體系熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖5插圖)，線性回歸方程為 Y=427.586X－677.022，線性相關(guān)系數(shù) R為0.99649。由此可以看出，該方法的線性范圍寬(跨越4個數(shù)量級)，檢測限低(102CFU/mL)，優(yōu)于基于ATP的生物熒光檢測方法(檢測限為103CFU/mL)和基于有機(jī)染料SYBR GreenⅡ的熒光檢測方法(檢測限為105CFU/mL)。并且該方法重現(xiàn)性好，總反應(yīng)時間短(從加樣到獲得最后的信號少于2 h)。綜上所述，基于MPA-CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)對細(xì)菌定量檢測的方法可用于一定數(shù)量范圍內(nèi)細(xì)菌的定量研究。

圖5 S.aureus數(shù)量與體系熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和線性關(guān)系圖(插圖)

2.6 實(shí)際樣品檢測

為了進(jìn)一步證實(shí)該方法的可行性和實(shí)用性，我們把該方法用于實(shí)際樣品的細(xì)菌計數(shù)中。表1即為5個實(shí)際樣品的測定結(jié)果。所有樣品在測試前都需經(jīng)過離心過濾純化。從表1可以得出，5個實(shí)際樣品的測試結(jié)果和常用的平板計數(shù)法基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)都在3.6～8.1之間，是非常令人滿意的，有望進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用。

表1 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本工作合成了具有優(yōu)良光學(xué)性能、分散性好、粒徑均一的CdSe/ZnS核殼量子點(diǎn)的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)。在EDC/NHS交聯(lián)作用下，以量子點(diǎn)作為熒光探針，金黃色葡萄球菌(S.aureus)作為目標(biāo)細(xì)菌，利用量子點(diǎn)表面羧基與細(xì)菌表面氨基之間的作用，建立了一種高靈敏的、簡單快速的細(xì)菌計數(shù)的新方法。在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，體系的相對熒光強(qiáng)度隨細(xì)菌數(shù)量的增加而增大，該方法的線性范圍為102CFU/mL～106CFU/mL，檢測限為102CFU/mL。該方法有效克服了有機(jī)熒光染料光穩(wěn)定性差等缺陷，具有簡單直接、條件溫和、檢測時間短(1 h～2 h)、靈敏度高和線性范圍寬(跨越4個數(shù)量級)等優(yōu)點(diǎn)。此外，我們還對5種實(shí)際樣品進(jìn)行了細(xì)菌計數(shù)，檢測結(jié)果與平板計數(shù)方法基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.6% ～8.1%之間，并且有好的重現(xiàn)性。

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