頭穴叢刺法對(duì)慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和HIF-1ɑ表達(dá)的影響

王春霞 許娜 王雅青 徐軍 孫遠(yuǎn)征

（1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院針灸三病房，哈爾濱150001；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040）

頭穴叢刺法對(duì)慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和HIF-1ɑ表達(dá)的影響

王春霞1許娜2王雅青2徐軍2孫遠(yuǎn)征1

（1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院針灸三病房，哈爾濱150001；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040）

目的通過(guò)觀察頭穴叢刺法對(duì)慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和HIF-1α表達(dá)的影響，探討頭穴叢刺治療慢性腦缺血的作用機(jī)制。方法26只大鼠采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）制備慢性腦缺血模型，造模成功的大鼠分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）和頭穴叢刺組（C組）。C組采用頭穴叢刺法，A組和B組不予治療。術(shù)后8周采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；免疫組化法檢測(cè)額葉皮層、海馬HIF-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果術(shù)后8周B組和C組逃避潛伏期和游泳路程均明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，與A組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；但C組與B組相比，逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，差異顯著（P＜0.05）。免疫組化A組偶見(jiàn)HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，B組和C組均可見(jiàn)HIF-1α表達(dá)增高，與A組比較差異顯著（P＜0.05)；C組較B組表達(dá)升高，差異顯著（P＜0.05)。結(jié)論頭穴叢刺能夠明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其可能通過(guò)促進(jìn)HIF-1α表達(dá)來(lái)提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

頭穴叢刺；慢性腦缺血；學(xué)習(xí)記憶能力；HIF-1α

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用健康雄性Wistar大鼠26只（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重（180±30）g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，采用Morris水迷宮訓(xùn)練5d，剔除游泳能力差的大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）8只和手術(shù)組18只，手術(shù)組死亡2只。術(shù)后4周再通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，造模成功的大鼠分為模型組（B組）和頭穴叢刺治療組（C組），每組8只。

1.2 模型制備參照Sarti[1]改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）制備慢性腦缺血大鼠模型。10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間有自主呼吸，取頸前部正中切口，鈍性分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）后結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈，逐層縫合，一星期后按照上面同樣步驟結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈后完成模型制作。假手術(shù)組僅分離暴露雙側(cè)CCA而不結(jié)扎。術(shù)后每日肌肉注射青霉素20萬(wàn)U/kg體重，預(yù)防感染，連續(xù)4d。

1.3 治療方法模型組：不予任何治療。頭穴叢刺組：參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取大鼠的百會(huì)和百會(huì)左右旁開(kāi)2mm三個(gè)穴位，大鼠頭頂部常規(guī)剪毛消毒，用0.35mm ×25mm毫針從后向前平刺6～8mm，留針30 min，每15 min捻針一次，頻率為200轉(zhuǎn)/分左右，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)3min，每日1次，共治療4周。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)以搜索持續(xù)時(shí)間（逃避潛伏期）和游泳軌跡（游泳路程）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間越長(zhǎng)，在這期間走的路程越長(zhǎng)，說(shuō)明其學(xué)習(xí)記憶能力越差；空間探索試驗(yàn)以大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)代表學(xué)習(xí)記憶能力，跨越平臺(tái)次數(shù)越少，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力越差。

1.5 標(biāo)本的采集各組大鼠造模后8周以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后仰臥位固定，快速剪開(kāi)胸腹腔，清晰暴露心臟和主動(dòng)脈弓，剪開(kāi)右心耳，速將輸液器針頭自心尖處通過(guò)左心室插入主動(dòng)脈，快速灌注0.9%生理鹽水約200m1，待液體從右心耳流出變清亮?xí)r，換用含4%多聚甲醛的0.1 MPBS（PH7.4）緩沖液200m1進(jìn)行灌注固定，斷頭取腦，取以視交叉為中心相當(dāng)于前聯(lián)合連續(xù)腦片繼續(xù)固定4～6h。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，用切片機(jī)切成5μm薄片，貼于載玻片上。將做好的石蠟切片放置在56℃烤箱中烘烤2h，使石蠟切片和載玻片緊密粘附，防止脫片。存放于干燥避光處用于免疫組化染色檢測(cè)。

1.6 免疫組化染色及結(jié)果判定免疫組化染色采用SP法，兔抗鼠HIF-1α抗體由武漢博士德公司提供。細(xì)胞質(zhì)、胞漿內(nèi)粉紅色至棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，應(yīng)用人工計(jì)數(shù)法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，每張切片選取3個(gè)400×鏡下視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以單個(gè)標(biāo)本為單位，取平均值，最后統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)

2.1.1 定位航行試驗(yàn)結(jié)果術(shù)后8周模型組和頭穴叢刺組大鼠逃避潛伏期和游泳路程明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組相比差異顯著（P＜0.05），大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退；頭穴叢刺組與模型組相比，逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善。見(jiàn)表1、表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與模型組比較△P＜0.05

組別例數(shù)逃避潛伏期假手術(shù)組8 11.83±1.63模型組8 29.28±3.86*頭穴叢刺組8 19.31±2.55*△

表2 各組大鼠游泳路程比較（±s,cm）

表2 各組大鼠游泳路程比較（±s,cm）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與模型組比較△P＜0.05

組別例數(shù)游泳路程假手術(shù)組8 637.51±82.72模型組8 1381.16±137.24*頭穴叢刺組8 1023.47±117.26*△

2.1.2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果術(shù)后8周與假手術(shù)組相比，模型組和頭穴叢刺組的跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，具有顯著性差異（P＜0.05）；但頭穴叢刺組與模型組相比跨越平臺(tái)次數(shù)增加，差異顯著（P＜0.05），學(xué)習(xí)記憶成績(jī)較模型組有明顯提高。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)比較（±s,次）

表3 各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)比較（±s,次）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與模型組比較△P＜0.05

組別例數(shù)跨越平臺(tái)次數(shù)假手術(shù)組8 6.38±0.92模型組8 2.75±0.31*頭穴叢刺組8 4.88±0.63*△

2.2 免疫組化檢測(cè)HIF-1ɑ結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1ɑ陽(yáng)性蛋白表達(dá)為胞核、胞質(zhì)內(nèi)呈粉紅色或棕黃色，額葉皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等均有表達(dá)。假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)分布正常，偶見(jiàn)HIF-1ɑ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。模型組和頭穴叢刺組可見(jiàn)HIF-1ɑ表達(dá)增高，與假手術(shù)組比較差異顯著（P＜0.05），而頭穴叢刺組較模型組表達(dá)更高，差異顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖1、2、3。

表4 各組大鼠額葉皮層、海馬HIF-1ɑ陽(yáng)性表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與模型組比較△P＜0.05

組別例數(shù)額葉皮層海馬假手術(shù)組8 0.057±0.011 0.00±0.00模型組8 0.368±0.025*0.398±0.028*頭針叢刺組8 0.561±0.045*△0.766±0.032*△

圖2 模型組大鼠額葉皮層、海馬HIF-1ɑ表達(dá)

圖3 頭穴叢刺組大鼠額葉皮層、海馬HIF-1ɑ表達(dá)

3 討論

大量研究表明，慢性腦缺血的病理機(jī)制十分復(fù)雜，是一個(gè)多基因和多靶點(diǎn)參與的過(guò)程，有多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)參與，臨床上主要表現(xiàn)為不同程度的認(rèn)知功能障礙，最終導(dǎo)致持久性或進(jìn)展性認(rèn)知和神經(jīng)功能障礙。孫莉等[2]已經(jīng)證實(shí)2VO后大鼠額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)腦血流量的減少，大鼠會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙。魏愛(ài)宣等[3]也通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2VO大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，證實(shí)了慢性腦缺血確實(shí)能夠使大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，并且隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶損害也呈進(jìn)行性加重。2VO術(shù)后大鼠反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢、進(jìn)食少、體重下降，但無(wú)明顯肢體癱瘓等癥狀，與人類(lèi)血管性認(rèn)知功能障礙癥狀相近，因此2VO適合于研究慢性腦缺血致大鼠認(rèn)知功能障礙。本實(shí)驗(yàn)采用了改進(jìn)的2VO法，可大大降低動(dòng)物的死亡率。

HIF-1α是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄因子，在常氧條件下表達(dá)水平很低，低氧時(shí)HIF-1α就會(huì)呈指數(shù)式地大量增加[4]。研究已經(jīng)證實(shí)HIF-lα為缺血、缺氧性損傷中最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一[5]，誘導(dǎo)其下游多種靶基因表達(dá)，參與缺血、缺氧后血管生成、血管重塑、能量代謝、血管舒縮反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與增殖、紅細(xì)胞生成等代償過(guò)程，以保持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)，具有重要的病理生理學(xué)意義。

頭穴叢刺法是針灸專家于致順教授依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，在相應(yīng)的刺激區(qū)，采用“叢式”針刺（每區(qū)刺入3～5針，以覆蓋病變部位為宜）進(jìn)行治療。頭穴叢刺法以透經(jīng)、透穴為特點(diǎn)，具有一經(jīng)帶多經(jīng)、一穴帶多穴的整合作用。這樣的針刺方法從針刺部位上來(lái)說(shuō)，使對(duì)頭部的刺激由原來(lái)的點(diǎn)狀刺激或線狀刺激擴(kuò)展到了面狀刺激，增加了針刺的刺激面積。這樣，在施用相同的針刺手法情況下，增加了刺激面積，也就是增加了刺激量，這是頭穴叢刺法優(yōu)于其它頭針療法的一個(gè)重要特點(diǎn)。

本研究結(jié)果說(shuō)明雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，造成了慢性腦缺血性認(rèn)知功能損害，頭穴叢刺針灸治療可以明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕慢性腦缺血大鼠額葉皮層和海馬的病理?yè)p害程度，故頭穴叢刺對(duì)慢性腦缺血后認(rèn)知功能下降大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能及皮層、海馬神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用，其可能通過(guò)上調(diào)HIF-1ɑ的表達(dá)從而促進(jìn)了機(jī)體的代償功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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10.3969/j.issn.1672-2779.2012.14.043

：1672-2779（2012）-14-0061-02

：馮麗媛

2012-05-16）