解析食品微生物檢驗(yàn)

董樹(shù)奎

摘要：通過(guò)幾年的工作感受，我認(rèn)為傳統(tǒng)食品微生物檢驗(yàn)生化試驗(yàn)的操作規(guī)程，雖然法規(guī)性較強(qiáng)，但由于沒(méi)有具體的檢驗(yàn)道理說(shuō)明，所以對(duì)于普通檢驗(yàn)員而言，多少會(huì)有些茫然，為此我覺(jué)得有必要根據(jù)所學(xué)做一點(diǎn)補(bǔ)充說(shuō)明。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗(yàn)

食品檢驗(yàn)的特點(diǎn)是：

①法規(guī)性：檢驗(yàn)方法必須采用國(guó)家法定的檢驗(yàn)方法，檢驗(yàn)結(jié)果具有法律效力。

②要檢驗(yàn)的菌少、雜菌含量多。

a需要增加要檢驗(yàn)的細(xì)菌。

b抑制雜菌。

③檢驗(yàn)的范圍廣。

④檢驗(yàn)結(jié)果具有數(shù)量界限。

⑤采樣后要求應(yīng)盡快檢驗(yàn)，快出結(jié)果，操作要慎重，結(jié)果要準(zhǔn)確。

1 生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)原理

在各種法規(guī)檢驗(yàn)方法中很重要的環(huán)節(jié)就是生化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)生化試驗(yàn)的原則就是：在試驗(yàn)過(guò)程中加入某些化學(xué)物質(zhì)，使細(xì)菌的代謝產(chǎn)物與加入的化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的變化或特征。以下是我對(duì)部分生化試驗(yàn)原理的解釋。

①過(guò)氧化氫酶及過(guò)氧化物酶試驗(yàn)原理：有些微生物可以將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣.

②甲基紅試驗(yàn)原理：一些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可被進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，使培養(yǎng)基的pH值下降到4.5以下，加入甲基紅呈紅色，陽(yáng)性。

③V-P試驗(yàn)原理：一些細(xì)菌分解葡萄糖為丙酮酸，進(jìn)一步脫酸產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰（丁二酮），進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。

④檸檬酸鹽試驗(yàn)原理：一些微生物可以以銨鹽作為唯一的氮源，以檸檬酸鹽作為唯一的碳源，在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽使培養(yǎng)基變成堿性，酸性指示劑變色。

⑤馬尿酸鹽試驗(yàn)原理：一些細(xì)菌可以水解馬尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和氯化鐵反應(yīng)生成苯甲酸鐵沉淀。

⑥硫化氫試驗(yàn)原理：有些微生物分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽反應(yīng)生成硫化亞鐵沉淀，使培養(yǎng)基變黑。

⑦靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）原理：一些細(xì)菌可以分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)，靛基質(zhì)可與對(duì)二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成紅色。

⑧卵磷脂酶試驗(yàn)原理：一些細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂產(chǎn)生甘油脂和水溶性的磷酸膽堿，在菌落周?chē)纬梢粋€(gè)乳白色的沉淀環(huán)或渾濁帶，在周?chē)幸粋€(gè)透明圈。

⑨脫氫酶試驗(yàn)原理：微生物有脫氫酶，可使氯化三苯四唑（TTC）還原，由無(wú)色變?yōu)榧t色，所以菌落變紅色。

⑩淀粉酶實(shí)驗(yàn)原理：一些細(xì)菌可產(chǎn)生淀粉酶將淀粉分解為雙糖或單糖，加入碘，菌落周?chē)蛔兩?/p>

⑾明膠液化實(shí)驗(yàn)原理：一些細(xì)菌可產(chǎn)生胞外酶，使明膠蛋白分解為氨基酸，從而失去明膠凝固能力。液化為陽(yáng)性，仍為固態(tài)為陰性。

⑿重點(diǎn)試驗(yàn)——三糖鐵試驗(yàn)（TSI）原理：

1.1 成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）

三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%。

酚紅指示劑、瓊脂（pH值調(diào)至7.4，培養(yǎng)基擺成高層斜面）。

1.2 接種：

①穿刺接種。

②斜面劃線接種（36℃培養(yǎng)18-24h）。

1.3 觀察結(jié)果：

①分解葡萄糖、乳糖和蔗糖。斜面產(chǎn)酸變?yōu)辄S色（陽(yáng)性），底層產(chǎn)酸變?yōu)辄S色（陽(yáng)性）。

②分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖。斜面、底層都產(chǎn)酸，都變?yōu)辄S色（陽(yáng)性）。

③分解葡萄糖，不分解乳糖和蔗糖。斜面產(chǎn)堿顯紅色（陰性），底層產(chǎn)酸顯黃色（陽(yáng)性）。

④分解含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫。硫化氫與亞鐵離子生成硫化亞鐵，使培養(yǎng)基變黑。

⑤分解糖類(lèi)產(chǎn)氣，培養(yǎng)基中有氣泡或裂縫。

2 前沿技術(shù)的應(yīng)用原理

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定﹙ELISA﹚原理：酶與Ab或Ag與相應(yīng)的Ag或Ab結(jié)合，事先將待測(cè)標(biāo)本吸附在固相載體表面，標(biāo)本中的Ag（或Ab）亦吸附在固相載體的表面，加入酶標(biāo)Ab（或Ag），酶標(biāo)Ab（或Ag）與相應(yīng)Ag（或Ab）結(jié)合后不能被緩沖液沖掉。當(dāng)加入酶相應(yīng)的底物時(shí)，由于酶的催化作用，底物發(fā)生反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，顏色的深淺與酶作用于底物所形成的有色物質(zhì)的量有關(guān)，即與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的Ag（或Ab）的量成正比。

2.1.1 注釋?zhuān)汗滔噍d體：（聚苯乙烯）

①吸附（也稱(chēng)包被）；Ag或Ab吸附到固相載體的過(guò)程，也稱(chēng)之酶標(biāo)板的致敏。

②封閉：用牛血清填補(bǔ)固相載體上剩余的位點(diǎn)。

2.1.2 基本方法：

①4℃過(guò)夜包被Ab或Ag。

②PBS沖洗三遍，每次3分鐘。

③加入酶標(biāo)Ab或Ag（37℃濕盒孵育30分鐘）。

④PBS沖洗三遍。

⑤加入OPD和Ｈ2Ｏ2反應(yīng)15-30分鐘。

⑥用2Ｍ濃硫酸終點(diǎn)反應(yīng)（酶作用時(shí)間越長(zhǎng)，顏色越深，濃硫酸使酶失去活性）。

⑦用酶標(biāo)儀測(cè)OD值（吸光值）。

此測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性（非特異反應(yīng)）。

2.2 PCR技術(shù)（P-聚合酶 C-鏈 R-反應(yīng)）

2.2.1 儀器：PCR儀

2.2.2 三個(gè)溫度：變性溫度90-95℃

退火溫度40-60℃

反應(yīng)溫度（合成ＤＮＡ）70-75℃

2.2.3 引抑為一小段寡聚合苷酸，酶為T(mén)ag酶。

PCR是擴(kuò)增DNA，最終與已知菌（即對(duì)照）的DBA用電泳方法比較，若相同則是待測(cè)菌。