牦牛尿嘌呤衍生物排出量對(duì)皺胃注射酵母RNA水平的響應(yīng)

王虎成，葉得河，周建偉，龍瑞軍＊

（1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

牦牛是分布在青藏高原及周邊地區(qū)特有的家畜遺傳資源。中國(guó)現(xiàn)有牦牛1 400多萬(wàn)頭，約占世界牦?？倲?shù)的92%［1］。牦牛同當(dāng)?shù)夭刈寮捌渌贁?shù)民族的生產(chǎn)、生活、文化、宗教等有著密切的關(guān)系，發(fā)展牦牛業(yè)對(duì)提高藏族及其他少數(shù)民族的生活水平有著十分重要的意義。由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，決定了牦牛是唯一能充分利用青藏高原天然草地資源進(jìn)行動(dòng)物性生產(chǎn)的牛種，因此在其分布地區(qū)具有不可替代的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)學(xué)地位。特別是在地球生態(tài)環(huán)境日益惡劣、稀有物種不斷消失的今天，以牦牛、藏羊?yàn)橹黧w的高寒生態(tài)生產(chǎn)體系所具有的潛力及面臨的危機(jī)，已引起了世人廣泛的重視［2－5］。多年來(lái)，廣大科研工作者在牦牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面進(jìn)行了能量代謝［6－9］、瘤胃消化生理［10－12］、氮代謝及補(bǔ)氮技術(shù)的研究［8，13］，填補(bǔ)了該畜種營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的空白。最近研究亦揭示了牦牛在牧食行為［14］、代謝物腎臟調(diào)控［15］和采食器官形態(tài)結(jié)構(gòu)［16］諸方面有別于黃牛的高原適應(yīng)機(jī)制，但受高原氣候及牦牛生活習(xí)性的影響，傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)方法的應(yīng)用正面臨著挑戰(zhàn)。Topps和Elliot［17］研究發(fā)現(xiàn)尿嘌呤衍生物排出量與小腸吸收微生物蛋白數(shù)量存在相關(guān)性，Verbic等［18］通過(guò)給閹牛皺胃連續(xù)灌注微生物核酸，發(fā)現(xiàn)有77%核酸以尿囊素和尿酸的形式被排出，通過(guò)皺胃注射嘌呤堿基，許多試驗(yàn)室已測(cè)定了注射嘌呤在尿中回收率，并進(jìn)一步建立相關(guān)模型，基于此類模型，利用尿嘌呤衍生物估測(cè)瘤胃微生物產(chǎn)量模型亦被建立［19－24］。但模型的相關(guān)參數(shù)因動(dòng)物種屬及生境而存在差異［25－29］。基于牦牛所處生活環(huán)境的獨(dú)特性，以及利用尿嘌呤衍生物估測(cè)瘤胃微生物產(chǎn)量模型的特異性，本研究旨在借助皺胃瘺管注射技術(shù)，以酵母RNA為嘌呤堿基供體，測(cè)定牦牛吸收嘌呤回收率，為建立快速、高效監(jiān)測(cè)牦牛瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量方法（purine derivative，PD法）奠定量化基礎(chǔ)，以期改善放牧牦牛管理系統(tǒng)，使青藏高原草地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能［30］得以有效體現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及皺胃手術(shù)

1.1.1 動(dòng)物 2010年4月于天祝藏族自治縣白牦牛產(chǎn)區(qū)選取體況相近的3頭成年閹牦牛，在烏鞘嶺試驗(yàn)站舍飼1周后進(jìn)行皺胃瘺管手術(shù)，經(jīng)30d康復(fù)后進(jìn)行皺胃注射試驗(yàn)，試驗(yàn)期室內(nèi)平均溫度5℃，相對(duì)濕度為60%。

1.1.2 牦牛皺胃瘺管手術(shù) 皺胃瘺管：選擇中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛研究中心研制的中號(hào)T－型瘺管（內(nèi)徑1.7cm，高9.8cm，長(zhǎng)9.7cm），對(duì)基部做適當(dāng)修整，以利于更緊地貼于胃內(nèi)壁。

術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前禁食24h，禁水12h。腹肋骨下緣皺胃區(qū)常規(guī)剪毛，術(shù)野面積為20cm×25cm，刮凈毛茬。手術(shù)器械、紗布和創(chuàng)巾等均高壓滅菌消毒，瘺管用溫水配制的0.1%新潔爾滅溶液浸泡消毒。

麻醉與保定：首先拴系固定試牛頭部，注射硫酸阿托品溶液2～5mL，15min后注射2% 靜松靈5～10mL進(jìn)行全身麻醉，使牛左側(cè)臥倒下，將牛于蹄部分前后綁定，頭部專人壓定。手術(shù)人員常規(guī)消毒，術(shù)部先用5%的碘酊消毒，再用75%的酒精脫碘。然后于牛左、右側(cè)均施行腰旁神經(jīng)傳導(dǎo)麻醉結(jié)合術(shù)部浸潤(rùn)麻醉。腰旁神經(jīng)傳導(dǎo)麻醉包括麻醉最后肋間神經(jīng)、髂下腹神經(jīng)和髂腹股溝神經(jīng)。刺入點(diǎn)分別為第一腰椎橫突游離端前緣、第二腰椎橫突游離端后緣和第四腰椎橫突游離端后緣，垂直皮膚進(jìn)針，每點(diǎn)深達(dá)骨面后沿骨緣下行1.0cm后注入2%的普魯卡因溶液10mL。在左側(cè)預(yù)行切口線部位分兩點(diǎn)注射0.5%的普魯卡因20mL浸潤(rùn)麻醉。

瘺管安裝：術(shù)野部做一與最后肋骨平行的10cm切口，用手術(shù)刀柄按肌纖維走向鈍性剝離腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌和腹直肌，切開(kāi)腹膜，打開(kāi)腹腔，將手伸入腹腔找到皺胃，將其順勢(shì)小心拉出，用腸鉗夾住皺胃，并用生理鹽水浸泡的滅菌紗布繞其下部塞住切口。在皺胃腹側(cè)部血管稀疏處做荷包縫合，于縫合圈內(nèi)做一約4cm切口，置入瘺管底座，擰緊瘺管冒，雙層荷包縫合，將腸道切口漿膜內(nèi)翻，套上圓形夾片，以無(wú)菌生理鹽水（每500mL生理鹽水內(nèi)加160IU青霉素和80IU鏈霉素）沖洗手術(shù)創(chuàng)口后還納胃部于腹腔，逐層縫合肌肉大切口，在原切口皮膚層后方作一略小于直管外徑（1.5cm）的小切口，用組織鉗拉出瘺管，縫合皮膚大切口，隨后用外夾片固定瘺管，創(chuàng)口外用碘酊進(jìn)行常規(guī)消毒。

術(shù)后護(hù)理：肌注320萬(wàn)IU青霉素和100萬(wàn)IU鏈霉素，連續(xù)注射7d，每天2次。動(dòng)物立即飲用溫水，并在術(shù)后第1周喂以少量易消化的日糧，隨后飼喂試驗(yàn)飼糧20d。術(shù)后當(dāng)日開(kāi)始每天于創(chuàng)口周?chē)镁凭虻怍耷虿料?遍。直到傷口愈合并拆線。

1.2 試驗(yàn)日糧及調(diào)制

試驗(yàn)期基礎(chǔ)日糧由豌豆秸稈草粉、豌豆和青稞面構(gòu)成，每頭牛每天飼喂2.4kg全價(jià)飼糧，分別于8：00和17：00分2次飼喂。每次飼喂前按60%草粉＋15%豌豆＋34%青稞面＋1%的復(fù)合添加劑（微量元素Co、Cu、I、Fe、Mn、Se、Zn含量依次為0.03，2.75，0.15，3.08，3.50，3.08，10.75mg／kg；維生素 A、D、E含量依次為921.0，251.0，6.4IU／kg）配比，加少量水拌勻后飼喂給試畜，試驗(yàn)期動(dòng)物自由飲水。

1.3 嘌呤堿基

1.3.1 試劑 酵母 RNA （ribonucliec acid from torula yeast，Sigma R6625，CAS 63231－63－0）為嘌呤堿基（purine base，PB）供體，含量為1.4mmol PB／g RNA。

1.3.2 溶液配制及注射 于注射前1d配制注射液。稱取一定量酵母RNA于400mL 0.1mol／L氫氧化鈉溶液，40℃攪拌溶解，用蒸餾水定容至1 000mL，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5～6，4℃儲(chǔ)存至次日注射。用蠕動(dòng)泵（BT00－100M）將PB溶液以0.7mL／min流速經(jīng)皺胃瘺管注入動(dòng)物體內(nèi)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)參照Guerouali等［31］方案執(zhí)行，分15d基礎(chǔ)日糧適應(yīng)期和20d注射期。其中注射期為4個(gè)處理（PB日均注射量分別為0，14，30，52mmol／d），2個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理適應(yīng)2d、采樣3d，共4期合計(jì)20d。

1.5 樣品采集及分析

依國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（International Atomic Energy Agency，IAEA）試驗(yàn)程序全收集尿樣［32］；尿肌酐、尿嘌呤衍生物（尿囊素和尿酸）測(cè)定參照李曉鵬等［33］的方法；尿氮測(cè)定參照楊勝［34］的方法。

1.6 回收率計(jì)算

回收率 （%）＝100×（PDi－PD0）／（PBi－PB0），式中，PDi為第i期尿嘌呤衍生物排出量；PD0為第1期尿嘌呤衍生物排出量；PBi為第i期嘌呤堿基注射量；PB0為第1期嘌呤堿基注射量；i＝2，3，4。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 13.0線性回歸方法建立嘌呤衍生物排出量與注射嘌呤之間的等式。處理效應(yīng)按程序GLM（general linear models）由多項(xiàng)式比較（polynomial contrasts）實(shí)現(xiàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物體況

3頭動(dòng)物于第一期同時(shí)參加試驗(yàn)，2d預(yù)注射發(fā)現(xiàn)，其中1頭動(dòng)物應(yīng)激性較強(qiáng)，故退出試驗(yàn)。另外2頭動(dòng)物整個(gè)注射期一切正常，且試驗(yàn)前后體重?zé)o明顯變化。

2.2 牦牛皺胃嘌呤注射量與尿嘌呤衍生物排出量關(guān)系

在連續(xù)注射嘌呤堿基條件下，牦牛尿嘌呤衍生物由尿囊素和尿酸組成，且各試驗(yàn)期動(dòng)物尿樣未檢出黃嘌呤和次黃嘌呤（表1）。回歸分析發(fā)現(xiàn)，牦牛皺胃嘌呤注射量（X，mmol／d）與尿嘌呤衍生物排出量（Y，mmol／d）間存在如下關(guān)系：Y＝0.85X＋33.02（R2＝0.96，n＝8，P＜0.001）。

表1 牦牛皺胃嘌呤注射量與尿嘌呤衍生物排出量間關(guān)系Table 1 Urinary excretion of PD in relation to purine supply to abamosum in yak

2.3 牦牛皺胃嘌呤注射量對(duì)尿嘌呤衍生物、肌酐及尿氮排出量的影響

牦牛皺胃連續(xù)注射酵母RNA可導(dǎo)致尿中尿囊素（564～1 426μmol／kg BW0.75）（表2）、總嘌呤衍生物排出量（629～1 507μmol／kg BW0.75）及尿囊素占總PD比例（0.90～0.95）線性提高（P＜0.01）；尿酸所占比例（0.10～0.05）則線性降低（P＜0.001）；PB注射水平對(duì)尿酸、肌酐及尿氮排出量影響不顯著（P＞0.05）。

表2 牦牛皺胃嘌呤注射量對(duì)尿嘌呤衍生物，肌酐及尿氮日排出量的影響Table 2 Effect of abamosum purine infusion level on daily urinary excretion of purine derivatives，creatinine and nitrogen of yak

3 討論

3.1 牦牛外源性嘌呤供給量對(duì)尿嘌呤衍生物組成的影響

本研究結(jié)果表明，牦牛連續(xù)注射嘌呤堿基并不影響尿嘌呤衍生物的組分（尿囊素和尿酸），且尿囊素為主要的構(gòu)成部分（≥0.90），但其構(gòu)成比例則會(huì)受到顯著影響?？傮w趨勢(shì)為隨嘌呤堿基注射量的增加，尿囊素比例顯著升高（P＝0.002），而尿酸所占比例變化趨勢(shì)與之相反（P＜0.001）。下列研究也有類似的發(fā)現(xiàn)：Pimpa等［29］給黃牛（Bosindicus）十二指腸連續(xù)注射腺苷和鳥(niǎo)苷發(fā)現(xiàn)，隨著PB注射量的增加（0～45mmol／d），尿囊素占總PD比例線性增加（0.75～0.90），尿酸所占比例線性降低（0.22～0.09）；Chen等［19］給綿羊皺胃注射PB（0～45mmol／d），尿囊素占總PD比例線性增加（0.56～0.81），尿酸所占比例線性降低（0.27～0.10）。上述趨勢(shì)基于嘌呤堿基在體內(nèi)的代謝規(guī)律，亦即，進(jìn)入血液的一部分外源性嘌呤通過(guò)補(bǔ)救合成途徑合成核酸補(bǔ)充組織損失，而另一部分則被降解為嘌呤衍生物隨尿排出體外，由于動(dòng)物體絕大部分黃嘌呤氧化酶存在于肝臟和腸粘膜，當(dāng)嘌呤堿基經(jīng)過(guò)腸粘膜時(shí)被脫氨基氧化生成尿酸，因而動(dòng)物通過(guò)補(bǔ)救合成組織核酸的幾率很小，需經(jīng)過(guò)直接合成途徑以補(bǔ)償組織的核酸損失，但是當(dāng)動(dòng)物被動(dòng)的給予遞增的外源補(bǔ)給量時(shí)，則利用外源性嘌呤合成體核酸以補(bǔ)償代謝損失。因此利用PD估測(cè)反芻動(dòng)物微生物蛋白產(chǎn)量時(shí)應(yīng)以其總量為參數(shù)，而非單一尿囊素?cái)?shù)值，尤其在飼養(yǎng)水平較低時(shí)更應(yīng)如此。

3.2 牦牛外源性嘌呤供給量與尿嘌呤衍生物排出量關(guān)系

反芻動(dòng)物血漿中嘌呤衍生物來(lái)源于體組織核酸的周轉(zhuǎn)及從腸道吸收而未用于合成體組織的外源性嘌呤。盡管血漿中嘌呤衍生物可通過(guò)腎臟排出體外，也可通過(guò)非腎臟途徑如唾液、奶和腸分泌物等分泌。大量研究結(jié)果表明，隨外源性嘌呤供給量的增加，反芻動(dòng)物尿嘌呤衍生物排出量亦線性提高。Belenguer等［35］給山羊注射0～17 mmol／d外源性嘌呤，則總尿嘌呤衍生物排出量從11.42增至26.07mmol／d；Chen等［19］給綿羊皺胃注射0～45 mmol／d PB，則PD排出量從2.06增至19.02mmol／d。更多的研究也表明尿中嘌呤衍生物的排出量與十二指腸核酸量或注入皺胃的核酸量相關(guān)，已建立的模型能很好地量化注入綿羊、山羊、牛皺胃或十二指腸中核酸量與嘌呤衍生物排出量間的關(guān)系［19－21，35］。與此同時(shí)，Chen等［19］和 Balcells等［20］相繼發(fā)現(xiàn)，綿羊和山羊因體組織酶活差異性，用曲線模型更能確切地描述二者的關(guān)系，并指出吸收嘌呤在尿中的回收率為0.84，由吸收的外源嘌呤補(bǔ)救方式合成代替直接合成的速率常數(shù)為－0.25，當(dāng)吸收的外源嘌呤量為0時(shí)，尿中排出內(nèi)源嘌呤衍生物量為0.15 mmol／kg BW0.75。然而，由于牛血液及組織中黃嘌呤氧化酶的活性較高，尿中排出嘌呤衍生物的數(shù)量與吸收嘌呤的數(shù)量關(guān)系與羊不同。本研究嘌呤回收率（0.85）與早期他人研究結(jié)果：0.85［18，26］，0.86［36］，0.84［37］一致。Wang等［15］絕食代謝研究結(jié)果表明，牦牛內(nèi)源性尿嘌呤衍生物日排出量為134μmol／kg BW0.75，基于本研究回收率參數(shù)，則牦牛吸收嘌呤（X，mmol／d）與尿嘌呤衍生物排出量（Y，mmol／d）的數(shù)學(xué)模型為：Y＝0.85X＋0.134kg BW0.75。

3.3 牦牛瘤胃微生物氮產(chǎn)量估測(cè)模型

Topps和Elliot［17］首次發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)容物中核酸濃度與尿中尿囊素排出量呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步研究表明，由于日糧中核酸在瘤胃中快速降解，故進(jìn)入十二指腸的核酸主要來(lái)自微生物，而微生物氮75%～85%以蛋白質(zhì)、肽或游離氨基酸形式存在，15%～25%存在于核酸中［38，39］。Chen等［19］指出，應(yīng)該使用總嘌呤衍生物（尿囊素、尿酸、黃嘌呤和次黃嘌呤，即PD在尿中的排泄量）作為估測(cè)參數(shù)，而非單一尿囊素，尤其當(dāng)動(dòng)物的采食量較低時(shí)更應(yīng)如此。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)牦牛尿囊素所占比例隨嘌呤吸收量的增加而變化，進(jìn)而表明利用總PD估測(cè)瘤胃微生物氮產(chǎn)量的合理性。Chen和Gomes［40］提出利用以下等式計(jì)算進(jìn)入小腸的微生物氮（MN，g／d）流量：MN＝（X×70）／（0.83×0.116×1000）＝0.727X，式中，X為小腸所吸收的外源嘌呤數(shù)量；70指每毫摩爾嘌呤含70mg氮；0.83指微生物核酸的消化率；0.116指混合微生物中嘌呤氮占總氮的11.6%。Ellis和Pfander［41］指出，瘤胃細(xì)菌嘌呤氮與細(xì)菌總氮比值十分恒定，變化范圍為10%～15%，Leng和Nolan［42］研究結(jié)果為8%～15%。韓興泰等［10］指出在能蛋比例固定條件下，日糧精粗比和日糧氮源不會(huì)明顯影響牦牛瘤胃細(xì)菌嘌呤氮與微生物總氮的比值，然而日糧粗蛋白質(zhì)水平卻顯著影響該比值，當(dāng)日糧粗蛋白質(zhì)水平為12%時(shí)，瘤胃細(xì)菌粗蛋白質(zhì)含量為37%，嘌呤氮占微生物總氮的比值為0.15，而當(dāng)日糧粗蛋白水平降至8%時(shí)，瘤胃細(xì)菌粗蛋白質(zhì)含量為29%，嘌呤氮占微生物總氮的比值為0.33。

本研究建立了牦牛吸收嘌呤與尿嘌呤衍生物排出量的數(shù)學(xué)模型，解決了利用尿嘌呤衍生物估測(cè)瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量瓶頸問(wèn)題，但受牦牛產(chǎn)區(qū)牧草產(chǎn)量及質(zhì)量隨季節(jié)而劇烈變化，牦牛瘤胃細(xì)菌嘌呤氮與細(xì)菌總氮比值參數(shù)亦不盡一致，已有模型并不完全適應(yīng)于牦牛生產(chǎn)實(shí)際，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入和完善。

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