象草4CL基因片段的克隆及RNAi表達載體構(gòu)建

霍松，陳慧，朱瓊?cè)A，解新明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642）

象草（Pennisetumpurpureum）系禾本科（Gramineae）狼尾草屬多年生C4草本植物。由于它具有產(chǎn)量高、再生能力強、營養(yǎng)豐富、適口性良好、抗逆性強等優(yōu)點，使之成為了熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的資源植物。象草無論是作為能源植物，還是飼用植物及造紙原料，其品質(zhì)與低木質(zhì)素含量密切相關(guān)［1－4］。

RNAi（RNA interference）是指一些與靶基因序列同源的小片段干擾RNA，可高效和特異性地使mRNA降解，從而導(dǎo)致內(nèi)源靶基因的沉默，最終產(chǎn)生相應(yīng)功能的表型缺失現(xiàn)象［5，6］。4－香豆酸：CoA連接酶（4－coumarate：CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素合成中的一個關(guān)鍵酶，其位于苯丙烷類衍生物生物合成的關(guān)鍵點上，以肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物，如4－香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5－羥基阿魏酸、芥子酸等為底物，生成相應(yīng)的輔酶A酯。這些中間產(chǎn)物隨后進入苯丙烷類衍生物支路合成途徑。其中生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA及芥子酰CoA轉(zhuǎn)化為肉桂醇衍生物，后通過還原反應(yīng)生成3種木質(zhì)素單體［7，8］。目前已從多種植物中分離了編碼4CL的cDNA序列［9］。然而，針對禾本科植物的研究，僅有水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays）和黑麥草（Loliumperenne）這3種植物［10－12］，同時在對4CL進行功能分析中，也未曾有人利用到RNAi技術(shù)。因此，利用RNAi技術(shù)開展對象草這種熱帶亞熱帶地區(qū)重要資源植物的4CL基因的研究，既具有重要的理論意義，又具有深遠的實踐意義。

目前有關(guān)植物RNAi載體的構(gòu)建有多種方法［13］。常規(guī)方法構(gòu)建RNAi載體需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，操作起來程序繁瑣，且連接效率較低。本實驗采用Gateway技術(shù)構(gòu)建入門克隆，利用TOPO異構(gòu)酶（topoisomerase）特性，能在5min內(nèi)快速高效地將PCR（polymerase chain reaction）產(chǎn)物整合到Gateway入門載體上，徹底簡化了PCR產(chǎn)物進入Gateway入門載體的步驟。表達克隆的構(gòu)建是利用LR反應(yīng)將目的基因從入門載體重組轉(zhuǎn)入目的載體［14］。本試驗設(shè)計1對特異性引物，PCR擴增目的片段，利用Gateway技術(shù)，將目的片段導(dǎo)入目的載體，形成具有ihpRNA結(jié)構(gòu)的高效表達載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。為下一階段通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)開展象草遺傳改良，培育新型象草種質(zhì)資源奠定重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在2010年進行。實驗所用材料為華南象草（P.purpureumcv.Huanan），種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寧西實驗基地和校內(nèi)躍進南牧草引種園。入門載體pCR?／GW／TOPO?vector購自Invitrogen公司；目的載體pCB2004B由中國科技大學(xué)向成斌教授實驗室惠贈。大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α和根癌農(nóng)桿菌（Agrobac－teriumtumefaciens）EHA105為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草生物技術(shù)實驗室保存菌種。TRIzol Kit、pCR?／GW／TOPO?TA Cloning?Kit、Gateway LR reaction Kit，PurelinkTMQuick Plasmid Miniprei Kit均購自于Invitrogen公司；TaKaRa Ex Taq聚合酶、DNA回收試劑盒，購自于TaKaRa公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的選擇及引物設(shè)計 根據(jù)本課題組從摩特矮象草中分離的4CL基因序列（登錄號：GU997597.1），與其他4種4CL基因［玉米、柳枝稷（Panicumvirgatum）、多年生黑麥草、水稻］做同源性比較，選擇同源性較高的部分，利用Primer 3（version 0.4.0）設(shè)計 PCR引物4CL－L（5′－AGCCGTTCCAGGTGAAGTC－3′）和4CL－R（5′－GGCGAGATCATCCTTCTCTG－3′）；同時在pCB2004B插入目的片段的兩端設(shè)計2對引物，04B－L1（5′－AT CACAAAGTGCCCATCACA－3′）和 04B－R1（5′－CTGGCGTAATAGCGAAGAGG－3′）、04B－L2（5′－GCGCGC TATATTTTGTTT－3′）和04B－R2（5′－CAGGGTTTTC CCAGTCAC－3′），用于檢測目的片段是否正確插入。所有引物均由Invitrogen有限公司合成。

1.2.2 目的片段的擴增 采用Trizol提取法從象草的幼嫩莖中提取總RNA，各步驟均按試劑說明書進行。用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量，用高質(zhì)量的RNA做下一步實驗。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的程序合成cDNA第一鏈。以該cDNA 20倍稀釋液為模板，采用50μL擴增體系：1μL反轉(zhuǎn)錄cDNA、5μL 10×PCR Buffer、4μL 2.5μmol／L dNTP、0.5μL 5U／μL TaKaRa Ex Taq?、10μmol／L 4CL－L和4CL－R各2μL，加入經(jīng)焦炭酸二乙酯處理過的超純水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min、95℃變性30s、55℃退火30 s、72℃延伸90s，35個循環(huán)后，于72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并用試劑盒回收目標條帶。

1.2.3 Gateway入門克隆的構(gòu)建 在0.5mL eppendorf管中，加入回收的目的片段2μL（約60ng），Salt Solution 1μL，TOPO vector 1μL，用滅菌超純水補至6μL體系，23℃連接5min，將目的片段定向克隆到pCR?／GW／TOPO?載體中，形成入門克隆載體pENTR－4CL。具體操作方法依據(jù)pCR?／GW／TOPO?試劑盒說明書進行。入門載體pENTR－4CL用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1TM－T1?感受態(tài)細胞中。將轉(zhuǎn)化細胞均勻涂在含壯觀霉素（100mg／L）LB（Luria－Bertani）固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5h，挑取單克隆到含有相同壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基，再振蕩培養(yǎng)5h。之后以4CL－L和4CL－R為引物，菌液為模板，PCR驗證陽性克隆。最后選取陽性克隆的菌液，送華大基因公司測序。測序引物為 M13通用引物（M13－L：5′－GTAAAACGACGGCCAG－3′，M13－R：5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′）。用試劑盒提取入門載體質(zhì)粒，方法參照試劑盒說明書進行，為表達克隆的構(gòu)建做準備。

1.2.4 Gateway表達克隆的構(gòu)建 LR反應(yīng)采用10μL體系：在0.5mL的eppendorf中加入pENTR－4CL3μL（約150ng），pCB2004B5μL（約250ng），LR ClonaseⅡ2μL，25℃反應(yīng)15h。加1μL蛋白酶 K，37℃反應(yīng)10 min，以終止反應(yīng)。片段克隆到pCB2004B載體中，形成表達克隆載體pCB2004B－4CL。取5μL反應(yīng)液熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞均勻涂在含卡那霉素（50mg／L）LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)14h，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基再振蕩培養(yǎng)14h。以4CL－L和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04BL2和04B－R2等3對引物作菌液PCR，鑒定陽性克隆。最后把陽性克隆菌液，送華大基因公司測序。測序引物為04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2。

1.2.5 農(nóng)桿菌表達克隆的構(gòu)建 將測序驗證正確的陽性克隆載體pCB2004B－4CL，用凍融法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌EHA105，以特異性引物4CL－L和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2進行PCR擴增驗證陽性菌落，同時以未轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌EHA105做陰性對照。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的獲得與驗證

用引物4CL－L和4CL－R，以經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測，和預(yù)期結(jié)果一致，長度大約為374bp（圖1）。經(jīng)進一步測序，得到如下序列：5′－AGCCGTTCCAGGTGAAG TCCGGGTCGTGCGGCACGGTGGTGCGGAACGCGGAGCTCAAGATCGTCGACCCCGACACCGGCGCCGC CCTCGGCCGGAACCAGCCCGGCGAGATCTGCATCCGCGGGGAGCAGATCGTGAAAGGGTACCTGAAC GACCCCGAGTCGACCAAGAACACCATCGACAAGGACGGGTGGCTGCACACCGGGGACATTGGTTACG TCGACGACGACGACGAGATCTTCATCGTCGACAGGCTCAAGGAGATCATCAAGTACAAGGGCTTCCA GGTGCCGCCGGCCGAGCTCGAGGCGCTCCTCATCACGCACCCGGAGATCAAGGACGCCGCCGTCGTCT CAGAGAAGGATGATCTCGCC－3′。該片段和摩特矮象草4CL基因的同源性為98%，證明為華南象草的4CL基因片段。

2.2 入門載體的陽性克隆檢測

將目的片段經(jīng)TOPO克隆后，可形成pENTR－4CL入門載體。pENTR－4CL載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，經(jīng)搖菌培養(yǎng)獲得菌液，以4CL－L和4CL－R為引物，對其進行PCR擴增，所得片段大小接近374bp（圖2），證明目的片段已成功連入載體。為了更進一步驗證克隆的準確性，筆者還以M13通用引物進行測序，測序結(jié)果和目的片段比對，同源性為100%，證明入門克隆構(gòu)建成功。

圖1 電泳檢測PCR擴增片段Fig.1 Detection of PCR amplification fragments

圖2 電泳檢測TOPO反應(yīng)陽性克隆Fig.2 Detection of positive clones from TOPO reaction by agarose gel electrophoresis

2.3 表達載體的陽性克隆檢測

經(jīng)LR反應(yīng)，將pENTR－4CL入門載體上的4CL目的片段轉(zhuǎn)移到目的載體pCB2004B上，進而形成pCB2004B－4CL表達載體。

為了驗證目的片段（RNA干涉片段）是否同時正確插入到表達載體的2個位點上，分別以04B－L1和04BR1，04B－L2和04B－R2這2對引物對表達載體pCB2004B－4CL的克隆產(chǎn)物進行了PCR驗證。由表達載體pCB2004B－4CL上引物的位置可知，這2對引物擴增的目的片段長度應(yīng)分別為548和772bp。使用這2對引物及目的片段上的4CL－L和4CL－R引物對3個克隆進行了PCR驗證。電泳結(jié)果表明，挑取的3個克隆均為陽性（圖3）。進一步測序，與目的片段比對，同源性為100%，證明表達克隆構(gòu)建成功。

2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其驗證

農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，被譽為“自然界最小的遺傳工程師”，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有簡便、高效、低拷貝數(shù)等特點［15］。借助農(nóng)桿菌的感染可實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。本研究也試圖通過農(nóng)桿菌將RNA干涉片段導(dǎo)入象草中。因此，將pCB2004B－4CL表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌是構(gòu)建RNAi表達載體的關(guān)鍵一步。本實驗通過凍融法將pCB2004B－4CL轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并以4CLL和4CL－R，04B－L1和04B－R1，04B－L2和04B－R2等3對引物對已轉(zhuǎn)化的EHA105菌液進行PCR擴增，檢測其是否含有表達載體。電泳結(jié)果表明，所挑取的2個克隆，均為陽性克隆（圖4，泳道1～6），同時以未轉(zhuǎn)化EHA105菌液做陰性對照，無條帶出現(xiàn)（圖4，泳道7～9）。

圖3 電泳檢測LR反應(yīng)陽性克隆Fig.3 Detection of positive clones from LR reaction by agarose gel electrophoresis

圖4 電泳檢測EHA105陽性菌液Fig.4 Detection of positive bacteria liquid of EHA105 by agarose gel electrophoresis

3 討論

3.1 RNA干涉片段的大小選擇

根據(jù)siRNA作用機制［16，17］，siRNA途徑是由雙鏈RNA（dsRNA）引起的序列特異性基因沉默，dsRNA被內(nèi)切核酸酶（Dicer）切割成21～23nt長的siRNA，此siRNA指導(dǎo)形成RISC蛋白復(fù)合物降解與之序列互補的mRNA，從而引發(fā)RNA沉默。目前，在植物中根據(jù)不同的實驗情況及不同的dsRNA來源，主要有2種介導(dǎo)方法引發(fā)RNAi機制：其一是發(fā)夾式RNA（hairpin RNA，hpRNA）介導(dǎo)的基因沉默，其二是病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。由于VIGS不能穩(wěn)定遺傳，在植物基因功能鑒定中的應(yīng)用有所局限。因此構(gòu)建hpRNA高效克隆和表達載體，并用于植物特定基因功能鑒定及表達調(diào)控是RNAi技術(shù)的研究熱點。RNA干涉載體以含有2個反向重復(fù)序列，中間夾1個內(nèi)含子所形成ihpRNA（intron－h(huán)airpin RNA）結(jié)構(gòu)的沉默效果最好，平均比例高達90%以上［16］。關(guān)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAi高效表達載體發(fā)夾結(jié)構(gòu)臂序列的選擇，以往研究認為序列長度具有一定的可塑性，在100～1 200bp均能取得良好的效果［18，19］。根據(jù)以往的經(jīng)驗，片段太短不利于實現(xiàn)高效率的RNA干涉；而太長的片段在構(gòu)建中容易引起與宿主菌重組，且太長的dsRNA結(jié)構(gòu)上不太穩(wěn)定，一般認為所選片段的大小在300～600bp最佳［16，18］。因此，本研究中選用了374bp的長度。選擇片段時，盡量選擇在本基因中保守，且與其他基因無同源性的區(qū)域作為RNAi片段，和其他基因序列連續(xù)相同的堿基數(shù)不超過20，以避免把其他非目標基因沉默［20］。筆者認為，如果所研究物種的公開基因序列很少，可以將所用目的片段的序列與其他親緣關(guān)系較近物種的全基因組進行比較，例如本研究就是通過與水稻的基因組進行比較，從而做出預(yù)判的。

華南象草的目的片段和摩特矮象草的同源性為98%，說明二者在4CL基因序列上是存在差異的。從木質(zhì)素含量上來看［21］，拔節(jié)后，華南象草無論是莖稈還是葉片的木質(zhì)素含量均高于摩特矮象草；從4CL酶活性來看，在不同發(fā)育階段，在這2個品種間也存在某種差異［3］。因此，在4CL基因片段上存在一定差異也就可以理解了，或許這正是上述差異的分子基礎(chǔ)。

3.2 Gateway系統(tǒng)的優(yōu)勢

本研究利用Gateway系統(tǒng)將目標基因的PCR產(chǎn)物直接插入到載體中，形成高效沉默系統(tǒng)。傳統(tǒng)的以酶切連接為基礎(chǔ)的植物RNAi表達載體構(gòu)建方法耗時費力、實驗周期長；以重組PCR技術(shù)為基礎(chǔ)結(jié)合酶切連接的植物RNAi表達載體構(gòu)建方法，也由于目的片段的選擇和內(nèi)引物的設(shè)計受到的限制因素較多，使其應(yīng)用受到了一定影響［13］。筆者采用的方法省去了酶切和連接的繁瑣步驟，并將目的片段的PCR產(chǎn)物直接進行TOPO克隆，在完成目的片段克隆的同時也完成了入門克隆的構(gòu)建，省去BP反應(yīng)過程，而且可以快速的應(yīng)用到其他帶有attR接頭位點的表達載體。

3.3 測序的重要性

在入門克隆的構(gòu)建過程中，有可能連接上和目的片段大小大約一致的PCR產(chǎn)物，僅以目的片段的引物做菌液PCR，或者以載體引物做菌液PCR驗證，均不能保證其PCR產(chǎn)物一定為目的片段，可能出現(xiàn)假陽性克隆，在實驗中會偶然出現(xiàn)類似情況，因此有必要進行測序驗證。構(gòu)建表達克隆所用的入門克隆載體，一定要用測序正確的菌液進行提取，不能隨便更換為其他PCR驗證正確的菌液。在載體上目的片段的兩端設(shè)計引物，既方便菌液PCR驗證，也可以用于測序。植物基因工程中，外源基因表達量不足是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的主要原因之一［22］，RNAi具有高度的特異性，如果有1個堿基與靶序列錯配，其干擾效應(yīng)可能將大大減弱［18］，因此任何一步的轉(zhuǎn)接都有必要做測序驗證。

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