日本腦炎病毒NS3基因截短表達(dá)及其在神經(jīng)細(xì)胞定位研究

鄧緒芳，史子學(xué)，魏建超，邵東華，王少輝，李蓓蓓，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

日本腦炎又稱流行性乙型腦炎，是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種嚴(yán)重?fù)p害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人畜共患傳染病，可引起人的致死性腦炎，重癥患者康復(fù)后有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。該病主要流行于東南亞，在中國除青海和新疆外，其他省均有流行。自使用弱毒疫苗免疫預(yù)防后，中國該病的發(fā)病率顯著降低，得到了很好的控制[1]，但每年仍有一定數(shù)量的發(fā)病病例。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，目前全球每年報(bào)告的發(fā)病人數(shù)在5萬例左右，其中約1/3的病例死亡，存活者20%～40%留有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴(yán)重后遺癥[2]。因此，開發(fā)治療性的抗病毒的藥物顯得尤為重要[3]。

JEV基因組全長10 976個(gè)核苷酸，除5'端95個(gè)核苷酸和3'端585個(gè)核苷酸為非編碼區(qū)外，其余10 296個(gè)核苷酸形成一個(gè)開放閱讀框（open reading frame, ORF），編碼一個(gè)3432個(gè)氨基酸的多蛋白前體，經(jīng)過酶切形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM和E）和 7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）[1]。NS3是黃病毒科中最保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，至少具有3種酶活性，參與了病毒蛋白的水解加工以及病毒的復(fù)制，是病毒復(fù)制的必需蛋白。NS3蛋白已成為研究抗該病毒藥物的重要靶標(biāo)分子[4]。在本研究中，我們克隆了NS3基因C端，在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，并制備了抗NS3的多克隆抗體，利用該抗體觀察了NS3在神經(jīng)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究JEV的致病機(jī)制提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 JEV為本研究室的豬源分離株（病毒滴度為4×108PFU/mL）；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET-28a（+）為本室保存；小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞系Neuro-2A（ATCC No.CCL-131）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；昆明系小鼠購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；rTaq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TA克隆試劑盒均購自大連寶生物公司；質(zhì)粒提取和DNA片段回收試劑盒購自天根生物技術(shù)公司；His-Band 蛋白質(zhì)純化試劑盒購自Novagen公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗和FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司；羊抗小鼠IgG Alexa Flour 594二抗購自Invitrogen公司；其他所需試劑和溶液參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》準(zhǔn)備。

1.2 方法

1.2.1 NS3基因C端（NS3C）的克隆與原核表達(dá) 根據(jù)GenBank已發(fā)表的日本腦炎病毒全基因組序列（登錄號(hào)：AF315119）設(shè)計(jì)NS3基因C端（955～1857 bp）特異性引物，上下游引物分別引入EcoR I和Sal I位點(diǎn)：上游5'-ATGGAAAATTTTCATGCC GCCTGGAACCACGG-3'；下游5'- GCGGTTCCGGAACTTAT CTCTTCCCTGC TGCA-3'。

提取JEV感染Vero細(xì)胞total RNA，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離，試劑盒快速回收DNA片段。DNA片段經(jīng)克隆測序驗(yàn)證后，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-NS3C，并轉(zhuǎn)化BL（DE3）細(xì)菌，用IPTG誘導(dǎo)后，12%SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)。

1.2.2 原核表達(dá)產(chǎn)物的純化及動(dòng)物免疫 將1.2.1中鑒定表達(dá)的重組陽性克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)，裂解細(xì)菌提取包涵體，用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化。純化的His-NS3C蛋白免疫昆明系小鼠（50～100μg/只）。初免用重組蛋白與完全弗氏佐劑（1:1），二次免疫用重組蛋白與不完全弗氏佐劑（1:1），以后直接免疫重組蛋白。連續(xù)免疫4次，間隔2周，末次免疫后7 d采血分離血清。

1.2.3 細(xì)胞感染病毒 Neuro-2A或Vero細(xì)胞用DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長到50%～70%密度時(shí)感染病毒，37℃吸附90 min，用PBS輕柔漂洗2次，再加入維持培養(yǎng)液（含1%胎牛血清DMEM）。感染24 h后，收獲細(xì)胞，進(jìn)行Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)。

1.2.4 抗血清特異性鑒定 抗血清特異性鑒定采用間接免疫熒光效價(jià)（indirect immunofluorescence assay, IFA）和Western blot方法，詳細(xì)步驟均見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.5 小鼠攻毒 取約1周齡的昆明系乳鼠6只：攻毒組3只乳鼠，將乙腦種毒液用PBS適度稀釋，每只小鼠腹腔注射病毒液0.25 mL（含病毒1.0×106PFU）。對(duì)照組小鼠3只，腹腔注射同樣體積的PBS。攻毒后每天觀察，當(dāng)攻毒組小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)癥狀時(shí)，分別取攻毒組和對(duì)照組小鼠腦組織，進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)。

1.2.6 免疫組化 組織固定按照常規(guī)進(jìn)行，新鮮組織用10%中性甲醛固定24 h后脫水，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，切片烘干后4℃?zhèn)溆?。免疫組化采用DAB顯色。切片經(jīng)0.3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，抗原修復(fù)后用10%山羊血清封閉，然后逐步進(jìn)行一抗和二抗孵育、DAB顯色，封片后在光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NS3C克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建 NS3基因位于JEV基因組4608～6464 bp間，全長為1857 bp，編碼68～70 kDa蛋白。本研究為了獲得針對(duì)NS3的抗體，用DNAStar-Protean軟件分析了NS3蛋白的抗原性（圖1），截取了抗原指數(shù)和親水性分值較高的C端（319～619 aa）進(jìn)行表達(dá)。將JEV感染Vero細(xì)胞24 h后收取細(xì)胞樣品，提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板擴(kuò)增編碼NS3蛋白C端的基因片段（約900 bp）（圖2A）。將PCR擴(kuò)增的片段插入TA克隆載體pMD-18T中測序，測序正確后，雙酶切下NS3C片段并插入pET-28a(+)載體，命名為pET-28a-NS3C（圖2B）。

2.2 NS3C在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-NS3C轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取單細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)菌中有大小約38 kDa的蛋白條帶，與目的蛋白大小相符（圖3）。將成功獲得表達(dá)的重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，使用His-Band蛋白純化試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行提純。軟件分析顯示純化的重組蛋白純度達(dá)到95%（圖3）。

圖1 NS3示意圖及其部分特性分析Fig.1 NS3 and its characteristics

圖2 NS3C克隆及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Cloning of NS3C and construction of its recombinant expressing plasmid

圖3 NS3C重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.3 Expression and purification of NS3C

2.3 NS3C抗血清的制備及特異性鑒定 將重組蛋白免疫昆明系小鼠，5免后收取血清。取等量的感染和未感染JEV的Vero細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行Western blot分析，一抗為適當(dāng)比例稀釋的NS3C抗血清，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。如圖4所示，在JEV感染組出現(xiàn)一條大小約72 kDa大小的條帶，與預(yù)計(jì)NS3蛋白大小相符，而未感染細(xì)胞樣品（mock）中沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，說明該抗血清能特異識(shí)別病毒感染細(xì)胞中的NS3蛋白。

圖4 NS3C抗血清識(shí)別病毒感染Vero細(xì)胞中的NS3蛋白（Western blot）Fig.4 NS3C antiserum reacted with NS3 expressed in JEV-infected Vero cells (Western blot)

將96孔中的Vero細(xì)胞感染JEV，24 h后固定，進(jìn)行IFA分析，一抗為適當(dāng)比例稀釋的NS3C抗血清。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在JEV感染組細(xì)胞中有特異性亮綠色熒光，而且主要集中在胞漿中，而未感染組細(xì)胞（mock）僅見微弱的綠色背景，無亮綠熒光（圖5），表明抗血清能特異識(shí)別病毒感染細(xì)胞中的NS3蛋白。

2.4 NS3在小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位 JEV具有嗜神經(jīng)特性，能在神經(jīng)元細(xì)胞中復(fù)制并引發(fā)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)將JEV感染小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞系Neuro-2A，用NS3C抗血清檢測NS3蛋白的亞細(xì)胞定位。從圖6可以看出，NS3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且可在細(xì)胞延伸出的突觸中檢測到（圖6A，箭頭指示）。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白在細(xì)胞核周圍分布明顯（圖6D，箭頭指示）。

2.5 NS3在小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞定位 JEV感染小鼠的腦組織石蠟切片，用NS3C抗血清進(jìn)行免疫組化染色，觀察NS3在腦組織中的表達(dá)定位。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在大腦免疫組化切片中可以看到NS3染色明顯（棕褐色），多種細(xì)胞中呈現(xiàn)NS3染色，主要細(xì)胞為椎體神經(jīng)元細(xì)胞，NS3主要定位于胞漿（圖7A和7B，箭頭所示）。而未感染小鼠腦組織切片內(nèi)，未觀察到明顯棕褐色染色（圖7C和7D）。

3 討論

圖5 NS3C抗血清識(shí)別病毒感染細(xì)胞中的NS3蛋白（IFA）Fig.5 NS3C antiserum reacted with NS3 expressed in JEV-infected Vero cells (IFA)

日本腦炎病毒是一個(gè)具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義的病原，開發(fā)抗該病毒的治療性藥物具有重要的意義。由于JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制中發(fā)揮重要的作用，因此這些非結(jié)構(gòu)蛋白成為藥物靶標(biāo)分子的重要研究對(duì)象。

圖6 NS3蛋白在小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞Neuro-2A中的亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of NS3 protein in Neuro-2A

圖7 免疫組化分析NS3在小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞定位Fig.7 Localization of NS3 in mouse brain by immunohistochemistry assay

NS3是一個(gè)多功能蛋白，至少具有3種酶活性：絲氨酸蛋白酶活性、核苷酸磷酸酶活性（NTPase）和RNA解旋酶活性（helicase）[6,7]。其中，絲氨酸蛋白酶活性位于蛋白N端，NTPase和helicase活性位于蛋白的C端。研究者們以NS3蛋白的這些酶活性作為靶標(biāo)，開始抗病毒研究。此外，有研究報(bào)道HCV NS3蛋白與腫瘤抑制因子p53蛋白有相互作用，具有抗凋亡功能，并能夠抑制p53的生物學(xué)活性[8,9]。這些數(shù)據(jù)都表明，NS3蛋白在病毒復(fù)制過程中，不僅作用于自身，也作用于其宿主細(xì)胞因子。遺憾的是，這些作用的詳細(xì)機(jī)制尚未明了。

為了獲得高效表達(dá)的重組蛋白和特異性好的抗體，用于開展NS3與宿主細(xì)胞的互作的研究，我們分析了NS3蛋白的抗原性和親水性，選擇克隆了NS3基因的C端，并在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。通過免疫小鼠，成功研制出具有良好特異性的抗血清，為進(jìn)一步研究NS3生物學(xué)功能提供了有利的工具。我們利用所制備的NS3C抗血清初步分析了NS3蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，觀察到NS3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并也可在神經(jīng)細(xì)胞的突觸中檢測到NS3，這些結(jié)果為研究NS3蛋白的生物學(xué)功能提供了參考。

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