化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響

趙見文田軍彪張顏偉李佃貴楊麗靜

（1河北醫(yī)科大學(xué)，河北省石家莊市中山東路361號(hào)，050017；2河北省中醫(yī)院）

實(shí)驗(yàn)研究

化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響

趙見文1田軍彪2張顏偉1李佃貴2楊麗靜2

（1河北醫(yī)科大學(xué)，河北省石家莊市中山東路361號(hào)，050017；2河北省中醫(yī)院）

目的：觀察化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的局部炎癥反應(yīng)的影響。方法：將50只昆明小鼠隨機(jī)均分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、尼莫地平組、假手術(shù)組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法合并尾端放血制造腦缺血再灌注模型。手術(shù)造模成功分別給予高、低劑量組化濁解毒活血通絡(luò)方中藥灌服。在治療后用放免法檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6、TNF -α的表達(dá)水平。結(jié)果：化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組小鼠中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯低于模型組，與假手術(shù)組及尼莫地平組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：化濁解毒活血通絡(luò)方可以抑制小鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，減少白細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低腦缺血再灌注損傷的程度。

化濁解毒活血通絡(luò)方；腦缺血再灌注；炎癥反應(yīng)；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

腦缺血再灌注損傷（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury）是一個(gè)以缺血缺氧為始動(dòng)因素，腦組織細(xì)胞在再灌注作用下所產(chǎn)生的包括炎癥反應(yīng)、氧自由基生產(chǎn)增多、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、凋亡基因激活等諸多環(huán)節(jié)共同存在從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。腦缺血誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子如白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）等的表達(dá)在腦缺血再灌注炎癥損傷中起著重要作用。化濁解毒活血通絡(luò)法是以濁毒理論［1-2］為指導(dǎo)，根據(jù)濁毒致病理論與腦系疾患的相關(guān)性研究而確立的中醫(yī)治療體系，廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病治療之中。本研究采用線拴法造成小鼠腦缺血再灌注模型，觀察化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)模型小鼠炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)的影響及其對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器及藥物 試驗(yàn)動(dòng)物：健康昆明雄性小鼠50只（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重20～23g，SPF級(jí)）。試驗(yàn)儀器：離心機(jī)、循環(huán)水真空泵、γ-放射免疫計(jì)數(shù)器、電子天平等?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方組成：菖蒲、茯苓、澤瀉、黃連、川芎、丹參、赤芍、當(dāng)歸、地龍、郁金等。對(duì)照組藥物：尼莫地平；試劑：TNF-α和IL-6放免檢測(cè)試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建 健康昆明小鼠50只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、中藥高劑量組、中藥低劑量組5組，每組10只。在25℃的無菌環(huán)境內(nèi)行手術(shù)造模。用10%水合氯醛以350mg/kg腹腔注射麻醉后，取仰臥位將小鼠四肢與牙齒分別固定于操作臺(tái)上，背部置一松軟棉墊，腹部覆蓋適量棉絮。在小鼠前頸部剪毛備皮，碘伏酒精常規(guī)消毒。頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套4號(hào)絲線扣備用，拉緊絲扣，阻斷血流。手術(shù)過程中動(dòng)作輕柔規(guī)范，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。術(shù)后可見小鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快、口唇發(fā)紫，同時(shí)在距尾尖1cm處剪斷放血。在放血過程中需謹(jǐn)慎觀察小鼠生命體征，放血約0.3mL迅速熱凝止血。阻斷血流10min松開絲扣，灌注10min后，再次阻斷血流10min，第二次再灌注后觀察10min，如小鼠呼吸、心跳平穩(wěn)，即可縫合皮膚，傷口處輕灑少量青霉素粉末以預(yù)防感染。其中假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，套絲扣不阻斷血流，尾部不放血，觀察時(shí)間與其他各組相同。隨后參考Longa等評(píng)分法［3］對(duì)小鼠的行為缺陷進(jìn)行評(píng)價(jià)，1～4分者納入后期試驗(yàn)，無神經(jīng)功能缺失癥狀及死亡者立即剔除并及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的給藥方法 腦缺血再灌注損傷模型小鼠于術(shù)后第二天開始給藥。假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水10mL/（kg·d）灌服。中藥高劑量組以上述中藥2.9g/（kg·d）灌服，中藥低劑量組以上述中藥1.45g/（kg·d）灌服。尼莫地平組灌服尼莫地平液0.03g/（kg·d），均每日1次，連續(xù)治療7d。

1.2.3 放免法檢測(cè)血清IL-6和TNF-α水平 各組小鼠于治療結(jié)束后以摘除小鼠眼球的方式取得血清，離心后取上清液，采用放免法檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量

2 結(jié)果

各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量見表1。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組與化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.01），化濁解毒方高劑量組、尼莫地平組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6與TNF-α水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），化濁解毒方高劑量組小鼠血清中IL-6、TNF -α含量顯著降低（P＜0.01）。與尼莫地平組比較，化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α顯著升高（P＜0.01），化濁解毒方高劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與化濁解毒方低劑量組比較，化濁解毒方高劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

IL-6是一種重要的前炎癥細(xì)胞因子，它是一種由多個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，具有較高的生物活性。在生理?xiàng)l件下，IL-6在腦內(nèi)的表達(dá)僅處于低水平狀態(tài)。腦缺血再灌注損傷后，隨著中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)IL-6表達(dá)明顯增加。TNF-α在腦組織中主要是由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞分泌產(chǎn)生。它具有復(fù)雜廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，能介導(dǎo)IL-6等多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和免疫調(diào)節(jié)，并參與影響脂質(zhì)以及糖類等物質(zhì)的代謝過程。腦組織缺血缺氧以及血液再灌注時(shí)，TNF -α能夠刺激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞使得白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞的凝血活性狀態(tài)被改變，PAF、TXA2、ET等縮血管物質(zhì)被釋放，進(jìn)而發(fā)生血管收縮并最終導(dǎo)致血管的急性閉塞。TNF-α還能使興奮性氨基酸釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中起著關(guān)鍵作用［4］。當(dāng)腦缺血再灌注損傷時(shí)，包括IL-6和TNF-α等在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多，在細(xì)胞表面浸潤(rùn)。IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的釋放增加繼發(fā)諸多級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致血腦屏障被打破，局部腦組織發(fā)生腫脹變性及神經(jīng)元的損傷。

本研究顯示，化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯低于局灶性腦缺血再灌注模型組，與假手術(shù)組及尼莫地平組比較無顯著性差異?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制腦缺血再灌注后炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生、拮抗TNF-α、IL-6引發(fā)的一系列損傷，以減輕其神經(jīng)毒性。但化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)于腦缺血再灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的氧自由基生成、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、凋亡基因激活等其他環(huán)節(jié)有無調(diào)節(jié)作用目前還不明確，尚待研究的進(jìn)一步深入。

［1］李佃貴，李海濱，裴林，等.慢性萎縮性胃炎從濁毒論治.四川中醫(yī)，2004，22（1）：17.

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［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson s，et al.Reversible midge Cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.stroke，1989，20（1）：84.

［4］Elkind MS，Coates K，Tai W.etal.Levels of acute phase proteins.remain stable after isehemie stroke.BMC Neur0l，2006，（16）6：37.

（2010-12-10收稿）

Impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on IL-6 and TNF-α in Rats with Ischemia-reperfusion Injury

Zhao Jianwen1，Tian Junbiao2，Zhang Yanwei1，et al.
（1 Hebei Medical University，Add.：No.361，Zhongshan East Road，Shijiazhuang，Hebei Province，postal code：050017；2 Heibei Hospital of Chinese Medicine）

Objective：To investigate impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on local inflammatory reaction in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：Forty Kunming mice were randomized to model group，high dose group，low dose group，Nimodipine group and sham operation group.Through ligature on bilateral carotid artery the disease model was established.The medication groups respectively

high dose or low dose of the Chinese medicine.After treatment，IL-6 and TNF-α levels were determined.Results：The high dose group showed significantly lower level of IL-6 and TNF-α than the model group did，but the difference was not significant in comparison to sham operation group and Nimodipine group.Conclusion：Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula can inhibit expression of inflammatory reaction factors，reduce inflammatory reaction so as to lower the intensity of ischemia-reperfusion injury.

Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula，ischemia-reperfusion injury，Inflammatory reaction，IL-6，TNF-α

國(guó)家中醫(yī)藥管理局濁毒證重點(diǎn)研究室專項(xiàng)課題（編號(hào)ZD200821-10）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃課題（編號(hào)2010020）