不同類型牡丹花期蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量變化

李亞杰,施江,胥華偉,張淑玲,霍志鵬,王建章

（1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南洛陽(yáng)471000；2.洛陽(yáng)國(guó)際牡丹園,河南洛陽(yáng)471000）

牡丹Paeonia suffruticosa屬芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia,多年生落葉小灌木,又名洛陽(yáng)花、富貴花,具有很高的觀賞價(jià)值和栽培價(jià)值[1].但是牡丹的自然花期較短,最佳觀賞期僅2～3 d,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們旅游觀賞的需要,所以探討牡丹花期的衰老機(jī)理和如何延長(zhǎng)牡丹花期顯得非常重要.牡丹為乙烯敏感型花卉[2],內(nèi)源激素的改變常常會(huì)帶來(lái)一系列的生理生化變化,蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的體現(xiàn)者,常在植物衰老過(guò)程中變化顯著,因此被認(rèn)為是重要的衰老指標(biāo)之一[3].而脯氨酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),一方面可以緩解脅迫帶來(lái)的滲透壓,另一方面還可以清除O2-、OH-等活性氧,維持蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu),此外,它還可以作為一種生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào),調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4].因此本文選用不同花期類型牡丹,探討其葉和花中可溶性蛋白和脯氨酸含量在開(kāi)花及衰老過(guò)程中的變化規(guī)律,希望能夠進(jìn)一步豐富牡丹衰老機(jī)理的研究,為牡丹花期調(diào)控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為牡丹早花品種‘鳳丹白’、中花品種‘洛陽(yáng)紅’和晚花品種‘玉樓點(diǎn)翠’,于2011年4-5月采自洛陽(yáng)國(guó)際牡丹園.參照王榮花等的標(biāo)準(zhǔn)[5],將花朵發(fā)育時(shí)期劃分為露色期（Ⅰ期）、綻口期（Ⅱ期）、初開(kāi)期（Ⅲ期）、半開(kāi)期（Ⅳ期）、盛開(kāi)期（Ⅴ期）和開(kāi)始衰敗期（Ⅵ期）.從牡丹植株上采切不同發(fā)育階段葉、花,用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,用于各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 可溶性蛋白含量的測(cè)定 稱取牡丹鮮樣0.2～0.5g,分3次總共加入5mL蒸餾水研磨勻漿,然后3000r/min離心10 min,取上清液0.1 mL于試管中,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合；放置5 min后在595 nm下比色,以5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液為CK,測(cè)定其吸光度,并通過(guò)以牛血清蛋白所作標(biāo)準(zhǔn)曲線求值,重復(fù)3次.根據(jù)以下公式計(jì)算其可溶性蛋白含量：

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值/μg,Vt為提取液總體積/mL,Vs為測(cè)定時(shí)的加樣量/mL,Mf為樣品鮮重/g.

1.2.1 脯氨酸含量的測(cè)定 將待測(cè)葉片擦拭干凈,剪碎混勻,分別稱取0.5 g,放入試管中,加入體積分?jǐn)?shù)為3%的磺基水楊酸5 mL,在沸水浴中提取10 min,提取過(guò)程中要不停地?fù)u動(dòng).取出試管冷卻以后過(guò)濾到干凈的試管中,濾液即為脯氨酸的提取液.吸取濾液2 mL于另一干凈的帶玻璃塞的試管中,并加入2 mL冰醋酸和2 mL體積分?jǐn)?shù)為2.5%的酸性茚三酮,沸水浴中加熱30 min,溶液即呈紅色.冷卻后加入5 mL甲苯,震蕩30 s,靜置片刻,取上部甲苯萃取物質(zhì),以甲苯為空白對(duì)照,在分光光度計(jì)上520 nm波長(zhǎng)下比色,測(cè)定其吸光值.測(cè)定2 mL待測(cè)液中脯氨酸的質(zhì)量濃度（μg/2 mL）.根據(jù)以下公式計(jì)算脯氨酸含量：

式中：C為2 mL測(cè)定液中脯氨酸的質(zhì)量濃度/（μg/g）,Vt為提取液總體積/mL,Vs為測(cè)定時(shí)的加樣量/mL,Mf為樣品鮮重/g.

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花期可溶性蛋白含量的變化

牡丹葉片中可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 牡丹葉片中可溶性蛋白含量的變化

由圖1可知,在開(kāi)花前期,3種牡丹葉片中可溶性蛋白含量略有上升,總體浮動(dòng)不大,這是由于葉片自身的生長(zhǎng)需要維持較高的蛋白質(zhì),以滿足其生理功能；在開(kāi)花后期葉片蛋白質(zhì)含量波動(dòng)不大,說(shuō)明牡丹葉片在花期沒(méi)有出現(xiàn)衰老的顯著特征,這與觀察現(xiàn)象一致.

牡丹花瓣中可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 牡丹花瓣中可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知,‘洛陽(yáng)紅’和‘玉樓點(diǎn)翠’花瓣蛋白質(zhì)含量略有上升,說(shuō)明花瓣有蛋白質(zhì)的合成,滿足其強(qiáng)烈的開(kāi)花需求及細(xì)胞增長(zhǎng),而從Ⅱ期后開(kāi)始逐漸下降,‘鳳丹白’花瓣蛋白質(zhì)含量則隨花期持續(xù)下降,表明隨牡丹花瓣的衰老,有機(jī)質(zhì)大量分解,異化作用加強(qiáng),花瓣可溶性蛋白含量降低.‘鳳丹白’和‘玉樓點(diǎn)翠’末期出現(xiàn)上升趨勢(shì),可能是隨著花的衰敗細(xì)胞活性降低,降解蛋白質(zhì)的能力下降,水分蒸發(fā)導(dǎo)致含量上升.

2.2 牡丹花期脯氨酸含量的變化

牡丹葉片中脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 牡丹葉片中脯氨酸含量的變化

由圖3可知,3種牡丹葉片在露色期到始衰期的脯氨酸含量不同,變化趨勢(shì)較為一致,呈逐漸上升狀態(tài),‘鳳丹白’和‘洛陽(yáng)紅’葉片升高較快,開(kāi)花末期略有下降,‘玉樓點(diǎn)翠’脯氨酸含量則是前期較為平緩,開(kāi)花末期急劇上升.分析認(rèn)為在牡丹開(kāi)花期,生殖生長(zhǎng)較為旺盛,會(huì)抑制葉片的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),而且葉片合成的有機(jī)物要向代謝旺盛的花瓣轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致本身滲透勢(shì)降低,從而誘導(dǎo)脯氨酸合成系統(tǒng),提高脯氨酸含量,緩解低滲透勢(shì)帶來(lái)的傷害,隨著花朵的衰敗,生殖生長(zhǎng)的抑制逐漸解除,脯氨酸含量出現(xiàn)下降趨勢(shì).另外,進(jìn)入4月下旬以后,溫度升高較快,最高達(dá)到37℃左右,晚花品種‘玉樓點(diǎn)翠’的葉片很可能受到高溫的脅迫,致使脯氨酸含量增加.

牡丹花瓣中脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 牡丹花瓣中脯氨酸含量的變化

由圖4可知,不同花期‘洛陽(yáng)紅’花瓣脯氨酸含量較高,‘鳳丹白’次之,‘玉樓點(diǎn)翠’較少,3種牡丹花瓣脯氨酸含量整體呈下降趨勢(shì),在開(kāi)花前期‘鳳丹白’和‘洛陽(yáng)紅’花瓣脯氨酸含量略有升高,然后逐漸下降,開(kāi)花末期不同品種都略有上升.較高的脯氨酸含量可以降低細(xì)胞的滲透勢(shì),促進(jìn)細(xì)胞吸水和開(kāi)花生長(zhǎng),另外,脯氨酸可以作為能量物質(zhì),為開(kāi)花提供能量.

3 結(jié)論與討論

在植物的成熟器官中,蛋白質(zhì)維持一種合成和分解的平衡狀態(tài),含量相對(duì)穩(wěn)定,但是隨著植物的衰老蛋白質(zhì)就會(huì)降解,細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸破壞,最終走向死亡[6].牡丹為多年生小灌木,葉片和花瓣表現(xiàn)出不同步的衰老現(xiàn)象,牡丹花期一般在四、五月份,從開(kāi)花到衰敗只有一周左右,而葉片生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),一般在十一月份左右脫落.許多研究認(rèn)為蛋白質(zhì)的含量是在植物衰老過(guò)程重要指標(biāo)之一[3],本研究發(fā)現(xiàn)在牡丹花期葉片蛋白含量基本穩(wěn)定,沒(méi)有出現(xiàn)衰老跡象,這與觀察現(xiàn)象相一致,而花瓣蛋白質(zhì)含量則呈下降趨勢(shì),蛋白質(zhì)逐漸降解會(huì)破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),增加膜透性,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂,清除O2-等氧自由基的功能受到抑制,膜質(zhì)過(guò)氧化加劇,最終導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡.

脯氨酸是植物在冰凍、干旱、高溫等脅迫條件下累積的主要有機(jī)分子,是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).在植物的光合器官和生殖器官中,往往有較多的脯氨酸積累,既有助于降低滲透壓,提高細(xì)胞持水能力,還可以參與氧自由基的清除.此外,1分子脯氨酸氧化可以提供32個(gè)ATP,可以作為能量底物,脯氨酸有助于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,這可能是植物對(duì)脅迫的生態(tài)適應(yīng)[7].本試驗(yàn)結(jié)果表明,葉片脯氨酸含量隨花期呈上升趨勢(shì),而花瓣脯氨酸含量呈下降趨勢(shì),后期略有上升.分析認(rèn)為,在牡丹花期,花瓣的劇烈活動(dòng)抑制葉片的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),而葉片營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向花瓣的運(yùn)輸進(jìn)一步增長(zhǎng),誘導(dǎo)了脯氨酸的合成,開(kāi)花后期隨著花瓣的衰敗生殖抑制逐漸解除,脯氨酸含量下降,晚花品種‘玉樓點(diǎn)翠’在開(kāi)花后期葉片脯氨酸快速升高可能是受較高氣溫的影響[8]；花瓣在前幾個(gè)時(shí)期有較高的脯氨酸含量,說(shuō)明脯氨酸促進(jìn)了牡丹花瓣的吸水生長(zhǎng),在清除系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害,并可能參與蛋白質(zhì)的合成以及劇烈的呼吸作用,在線粒體中氧化提供能量并逐漸消耗,脯氨酸含量隨花期開(kāi)始下降,半開(kāi)期和盛花期脯氨酸含量較少,對(duì)細(xì)胞的持水作用減弱,活性氧積累,并加劇了蛋白質(zhì)的降解,推進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,液泡當(dāng)中的脯氨酸釋放加劇,而且蛋白質(zhì)的降解一定程度上增加了開(kāi)花后期脯氨酸的含量.研究認(rèn)為外源脯氨酸可以提高植物的抗逆性,改變開(kāi)花時(shí)間和延長(zhǎng)花期[9],是否對(duì)牡丹有效有待進(jìn)一步研究.

蛋白質(zhì)的合成和脯氨酸的積累被認(rèn)為是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程,并不存在直接關(guān)系[10].本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉片和花瓣中蛋白含量和脯氨酸含量沒(méi)有顯著相關(guān)性,與上述結(jié)論相一致.另外,在牡丹開(kāi)花和衰老的過(guò)程中,不同時(shí)期葉片和花瓣中蛋白質(zhì)和脯氨酸含量發(fā)生明顯的變化.這種變化與品種類型、源-庫(kù)關(guān)系、以及花瓣的程序性死亡、乙烯等激素的調(diào)控等相關(guān)聯(lián),并且與牡丹花的衰老相對(duì)應(yīng),因此蛋白質(zhì)和脯氨酸含量變化可能在牡丹花衰老過(guò)程中起重要作用.

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