宮頸癌組織中HPV16型E6/E7序列突變分析＊

張志珊，莊建良，李愛祿，蔣燕成

宮頸癌與人類乳頭狀瘤病毒（HPV）的感染密切相關(guān)。HPV屬于性傳播疾病病原體，目前已鑒定出100多種基因亞型，其中至少有40個類型的HPV可以感染生殖部位，根據(jù)其致癌能力的大小分為高危型、中間型和低危型兩種，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、43、51、52、56、58、59、68、73、82等型，高危型HPV持續(xù)感染是激發(fā)宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化的最重要危險因素，是宮頸癌及癌前病變發(fā)生發(fā)展的必要條件［1］。

HPV的基因約長8kb，主要由早期基因（E區(qū)）、晚期基因（L區(qū)）和長控制區(qū)（LCR）組成，E區(qū)有6個開放讀框（ORF），編碼6個早期蛋白，即El－E7。其中E6、E7基因在細(xì)胞癌變中起重要作用。在持續(xù)感染高危型HPV病毒后，病毒基因組會整合到宿主染色體中，E6和E7基因的表達(dá)調(diào)控也受到干擾。E6、E7基因特定位點的突變會使病毒更易誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生癌變，增大再次感染或從宿主免疫系統(tǒng)逃逸的機會。本文對本自泉州地區(qū)的宮頸癌組織中HPV16型的E6、E7基因的序列進(jìn)行分析，探索HPV16型E6、E7基因突變情況及其與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性，這對于宮頸癌的防治及指導(dǎo)疫苗設(shè)計具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及DNA的提取 35例宮頸癌組織來自2009年1月－2010年12月本院婦產(chǎn)科宮頸癌術(shù)后樣本（經(jīng)病理檢查確診），這35例標(biāo)本在前期實驗中，通過對HPV亞型進(jìn)行分型檢測后，確定為HPV16型感染。全基因組DNA的提取采用QIAGEN公司的DNA mini kit。

1.2 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的 HPV16序列（EU918764），應(yīng)用 Premier 5.0軟件設(shè)計兩對引物分別用于擴(kuò)增E6、E7基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物如下：

1.3 PCR擴(kuò)增 引物E6F/E6R用于擴(kuò)增E6基因，E7F/E7R用于擴(kuò)增E7基因。反應(yīng)體系為：10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上、下游引物（20μmmol/L）各1μL，Ex Taq酶2.5U，模板1μL，加H2O至50μL。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃ 延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析 測得的序列用Sequencher軟件進(jìn)行編輯、校正后，使用ClustalX和BioEdit進(jìn)行基因的比對和多態(tài)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 HPV16E6基因變異分析 35例樣本的E6基因均成功擴(kuò)增并測序。將測序結(jié)果與HPV16型的野生株（德國標(biāo)準(zhǔn)株，基因號K02718）［2］進(jìn)行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35例樣本中有32例存在基因突變，突變率為91.4%。共涉及到12個位點的14種不同突變模式，其中10個位點的變異為錯義突變，另外2個位點為無義突變（A131C和T241G）。突變頻率最高的是178位點，35例樣本中有26例由原來的T突變?yōu)镚，1例突變?yōu)锳，結(jié)果均導(dǎo)致氨基酸的轉(zhuǎn)換D25E（77.1%）。其它位點突變導(dǎo)致的氨基酸轉(zhuǎn) 換 有 E113D，L83V，L28V，S138C，T21S，R144T，S142T，Q20P，T21I，R10G。突變頻率的分布見表1，E6氨基酸序列比對見圖1。

表1 HPV16E6基因變異分析Tab.1 Sequence variation of HPV 16E6in cervical cancer tissue

圖1 HPV16E6蛋白氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequences of HPV 16E6

2.2 HPV16E7基因變異分析 35例樣本中，成功測序的有28例。通過對E7基因進(jìn)行比對后，共發(fā)現(xiàn)5個突變位點，突變位點的數(shù)量低于E6基因，突變頻率與E6基因接近（89.2%）。氨基酸比對結(jié)果顯示，有2個位點為錯義突變，3個位點為無義突變（圖2）。28例樣本中有21例發(fā)生A647G突變，導(dǎo)致氨基酸的轉(zhuǎn)換（N29S），是突變頻率最高的位點（75.0%）。另有1例發(fā)生L28F的氨基酸轉(zhuǎn)換。在無義突變中，突變頻率從高到低分別為T846C（75.0%）、G666A（32.1%），T843C（21.4%）。突變頻率分布見表2。

表2 HPV16E7基因變異分析Tab.2 Sequence variation of HPV 16E7in cervical cancer tissue

3 討 論

HPV感染是宮頸癌的首要病因，在全世界范圍內(nèi)，最常見的感染亞型是HPV16型。不同的HPV16變異株具有不同的生物學(xué)活性和致癌潛能，其中某些位點的變異與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)［3－4］。來自世界范圍的分子流行病學(xué)資料顯示，E6基因的突變增強了致癌的危險性，同時這些突變株的致癌能力具有地域性［5］，Yamada等人曾報道在歐洲宮頸癌患者中，野生型E6基因（德國株）的分布頻率為34%［6］，隨后Zehbe等人報道，在瑞士宮頸癌患者中野生型E6基因的分布頻率僅為6%［3］，與Pillai等人報道的印度人群中9.1%的流行率接近［7］。本次研究結(jié)果顯示，35例宮頸癌患者中，有3例為野生型E6基因，僅占7.9%。在所有的E6突變位點中，報道最多的突變是T350G，不同的地域的分布頻率差別較大，從2%～93.5%不等［6，8－11］。此位點的變異導(dǎo)致E6蛋白L83V氨基酸轉(zhuǎn)換，使其對鱗狀上皮和腺上皮細(xì)胞生長轉(zhuǎn)化能力增強［4］，與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅰ級向Ⅲ級轉(zhuǎn)化有關(guān)［12］。而來自德國和俄羅斯的報道則認(rèn)為L83V變異與侵潤性癌無關(guān)［13－14］。本次研究發(fā)現(xiàn)，泉州地區(qū) HPV16E6基因L83V變異僅有3例，占7.9%，頻率最高的突變是D25E，占77.1%，其次為E113D，占11.4%。其它變異還有 L28V，S138C，T21S，R144T，S142T，Q20P，T21I，R10G。我們發(fā)現(xiàn)D25E變異在泉州地區(qū)宮頸癌患者中最為流行，這與以往 Wu Y［10］等人報道的65.5%，Kang［15］報道的85.2%接近。該變異在東亞人種的分布頻率高顯著高于其它地區(qū)，被認(rèn)為是亞洲型尤其是東亞病毒分枝的特異性變異。此次研究還發(fā)現(xiàn)了一些以往沒有報道過的變異，如T21S，Q20P，T21I，R10G，其變異的頻率較低，與宮頸癌的相關(guān)性有待于進(jìn)一步探討。

本研究顯示泉州地區(qū)宮頸癌患者中HPV16E7基因也存在高頻率的突變（89.2%）。與E6變異位點相比，本次研究中E7的變異位點相對較少，僅發(fā)現(xiàn)5個位點突變。只存在2種類型的錯義突變N29S和L28F，其余3種均為無義突變。突變頻率最高的是A647G突變（導(dǎo)致N29S氨基酸轉(zhuǎn)換）和T846C（無義突變），突變率均為75.0%，與 Wu Y報道的70.2%和67.1%相近［10］。在以往報道中，A647G和T846C是最常見的2種變異，但是突變的頻率差別較大。對于N29S的突變率，泰國宮頸癌患者為63.0%［16］，韓國為59.5%［17］，德國僅為0.9%［13］。這些資料顯示，N29S突變主要存在亞洲人群，而較少發(fā)生在歐洲人群中，提示E7變異具有明顯的地域性。研究還發(fā)現(xiàn)A647G和T846C這2種突變都是同時存在同一個樣本中。這個結(jié)果和熊光武［18］等人的報道一致，可能提示這是中國人群中特異的突變類型，對于研究針對中國人群的HPV疫苗提供一定的線索。

圖2 HPV16E7蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of HPV 16E7

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