藥效學(xué)優(yōu)化蒙藥“協(xié)日嘎－4”噴霧劑的提取方法

郭 建 張 濤 宋宏春

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院2006級(jí)研究生，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

“協(xié)日嘎 －4”是蒙醫(yī)驗(yàn)方[1，2]，該處方是由姜黃、黃柏、梔子和蒺藜(微炒)4味藥材組成，原劑型為洗劑，臨床用于治療真菌性皮膚病和細(xì)菌性皮膚病。擬將其劑型改革為現(xiàn)代劑型噴霧劑，以方便患者使用。

文獻(xiàn)資料報(bào)道“協(xié)日嘎－4”4味藥材中均含有抗真菌、細(xì)菌、抗炎和修復(fù)創(chuàng)傷的化合物。姜黃含有姜黃類物質(zhì)，為二苯基庚烴類:包括姜黃素(含量為1.8% ～5.4%)、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素和揮發(fā)油等[3，4]。其藥理作用有抗病原微生物作用;姜黃的醇提取液、姜黃素和揮發(fā)油具有抗病原微生物、抗病毒的作用，其中對(duì)黑曲霉的抑制作用最強(qiáng);姜黃乙醇提取物、姜黃素及其揮發(fā)油有抗革蘭陽(yáng)性菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、卡他球菌有抑制作用。姜黃乙醇提取物、姜黃素及其揮發(fā)油還對(duì)鼠瘧原蟲(chóng)有強(qiáng)抑制作用。姜黃揮發(fā)油洗劑具有抗石膏樣毛癬菌感染作用[5，6]。黃柏含有生物堿類:黃柏樹(shù)皮含小檗堿，藥根堿，木蘭堿，黃柏堿等[7]。其藥理作用有抗病原微生物作用:黃柏水煎劑、醇浸劑在體外對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌有抑制作用;對(duì)多種皮膚真菌有不同程度的抑制作用;對(duì)陰道滴蟲(chóng)也有抑制作用。黃柏水煎劑有較強(qiáng)的殺鉤端螺旋體的作用。黃柏對(duì)人結(jié)核桿菌、乙型肝炎表面抗原有抑制作用[8，9，10]。梔子含有環(huán)烯醚萜(甙)類:包括梔子甙即京尼平甙、羥異梔子甙和黃酮類化合物。藥理作用有抗病原微生物作用:體外實(shí)驗(yàn)證明梔子浸液對(duì)痢疾桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用。對(duì)部分真菌也有抑制作用。梔子浸液在體外可以殺死血吸蟲(chóng)的成蟲(chóng)及鉤端螺旋體等?？共≡⑸镒饔肹11，12，13]。蒺藜含有生物堿:哈爾滿堿、哈爾明堿、黃酮、蒽醌類等。藥理作用有抗病原微生物作用:蒺藜果實(shí)的水提物具有抗炎作用，能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長(zhǎng)。蒺藜對(duì)甲型流感病毒57－4株具有較強(qiáng)的抑制作用。蒺藜只對(duì)少數(shù)的細(xì)菌和真菌有抑制作用效果，具有較弱的抑菌作用[14，15，16]。根據(jù)上述文獻(xiàn)資料可知“協(xié)日嘎 －4”處方中藥材的水煎液，醇提取液、揮發(fā)油提取液均有抗病原微生物作用?！皡f(xié)日嘎－4”噴霧劑應(yīng)該選擇怎樣的提取工藝較為合理呢?本課題將依據(jù)循證醫(yī)學(xué)的方法通過(guò)藥效學(xué)優(yōu)化蒙藥協(xié)日嘎－4噴霧劑的提取工藝，為“蒙藥協(xié)日嘎－4噴霧劑的制備工藝”提供科學(xué)的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材:姜黃、黃柏、梔子、蒺藜(購(gòu)于內(nèi)蒙古惠豐藥業(yè))。

1.2 菌種

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用醫(yī)學(xué)真菌:包括白色念珠菌(C.albicams，編號(hào)為ATCC11006)、紅色毛癬菌(T.rubrum)、石膏樣小孢子菌(M.grpseum)、羊毛樣小孢子菌 (M.lanosum)、犬小孢子菌(Microsporum Canis)。(白色念珠菌為內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株;紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、羊毛樣小孢子菌及犬小孢子菌為內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科提供的臨床菌株)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)用醫(yī)學(xué)細(xì)菌:包括金黃色葡萄球菌(S.aureas，細(xì)菌號(hào)為26003)、炭疽桿菌(Bacillus?anthraci，細(xì)菌號(hào)為63601)、白色葡萄球菌(Staphylococcus，細(xì)菌號(hào)為26101)、變形桿菌(P.mirabilis，細(xì)菌號(hào)為49001)、綠膿桿菌(Pseudomonas，細(xì)菌號(hào)為 10102)、大腸桿菌 (E.coli，細(xì)菌號(hào)為44001)(實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌為內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株)。

3 培養(yǎng)基

1.3.1 淺部真菌及白色念珠菌選用沙氏麥芽糖蛋白胨瓊脂基，通稱沙堡弱培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar，SDA)，其成分為麥芽糖100g，蛋白胨25g，瓊脂 50g，蒸餾水2500ml。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)基成分為營(yíng)養(yǎng)瓊脂20g，蒸餾水400ml。

1.3.3 制法:將上述不同培養(yǎng)基的成分各自混合后，121℃，15分鐘滅菌后備用。

1.4 藥物:實(shí)驗(yàn)用蒙藥為內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室制備的協(xié)日嘎－4醇提取液、協(xié)日嘎－4水提取液、協(xié)日嘎－4混合提取液、協(xié)日嘎－4揮發(fā)油提取液;青霉素G陽(yáng)標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，單位10mg，產(chǎn)地為杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)為20080208，編號(hào)為Co23。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器:ESJ200－4型電子天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;YXQG01型電熱式蒸汽消毒器，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱;試管、平皿、酒精燈、無(wú)菌白金耳、接種環(huán)、、游標(biāo)卡尺。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 協(xié)日嘎－4提取液的制備:協(xié)日嘎－4水提液的制備:按處方量稱取藥材，即姜黃100g、蒺藜100g、梔子80g、黃柏60g，加入處方量8倍量的水，提取3次，每次3小時(shí)，合并水提液，濃縮至終濃度為0.4690g/ml(以生藥材計(jì))，濃縮液備用。

協(xié)日嘎－4醇提液的制備:按處方配比，取上述四味藥，加入8倍量60%乙醇，提取3次，每次3小時(shí)，合并醇提液，濃縮，回收乙醇，使藥液終濃度為0.4690g/ml(以生藥材計(jì))。

協(xié)日嘎－4混和提取液的制備:按處方配比，取上述四味藥，加入8倍量60%乙醇，提取3次，每次3小時(shí)，合并醇提液，濃縮，在藥材中再加入處方量8倍量的水，提取3次，每次3小時(shí)，合并水提液，濃縮，將二者濃縮液合并，調(diào)整使其終濃度為0.4690g/ml(以生藥材計(jì))。

協(xié)日嘎－4揮發(fā)油提取液的制備:按處方配比稱取藥材，置揮發(fā)油提取器中，加入處方量8倍量的水，提取8小時(shí)，在水中加入少量的吐溫－80，使揮發(fā)油溶解，濃度調(diào)整為0.4690g/ml(以生藥材計(jì))。

2.2 協(xié)日嘎－4提取液抑制真菌實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果:采用沙堡弱(SDA)培養(yǎng)基，分別制成含協(xié)日嘎－4提取液30%(0.1407g/ml)、20%(0.0938g/ml)、10%(0.0469g/ml)、5%(0.02345g/ml)的培養(yǎng)基，將白色念珠菌、羊毛樣小孢子菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌的菌種分別接種在含不同濃度的藥物培養(yǎng)管內(nèi)及空白對(duì)照組，置于30℃溫箱中，2周后觀察，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同協(xié)日嘎－4提取液對(duì)真菌的抑制作用

由表1可知，協(xié)日嘎－4揮發(fā)油提取液各濃度組對(duì)真菌都無(wú)抑制作用;水提液只有30%組(0.1407g/ml)對(duì)真菌有抑制作用，其余濃度組都無(wú)抑制作用;醇提液20%組(0.0938g/ml)、30%組(0.1407g/ml)對(duì)真菌有抑制作用，其他濃度組無(wú)抑制作用;而混和提取液10%組(0.0469g/ml)、20%組(0.0938g/ml)、30% 組(0.1407g/ml)對(duì)真菌都有抑制作用，只有5%組(0.02345g/ml)無(wú)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明協(xié)日嘎－4揮發(fā)油提取液對(duì)真菌無(wú)抑制作用，水提液及醇提液對(duì)真菌均有一定的抑制作用，混合提取液抑制真菌的效果最好。

2.3 協(xié)日嘎－4提取液抑制細(xì)菌實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果:采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)平皿放置兩個(gè)直徑為5mm的滅菌不銹鋼小管，管內(nèi)分別加入200ul(C=0.4690g/ml)的提取液和空白對(duì)照液，平皿內(nèi)分別放入青霉素G(10ug)標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24小時(shí)觀察藥物對(duì)細(xì)菌的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同協(xié)日嘎－4提取液對(duì)細(xì)菌的抑制作用

由表2可知協(xié)日嘎－4揮發(fā)油提取液對(duì)各細(xì)菌都無(wú)抑制作用;水提液、醇提液及混合提取液對(duì)細(xì)菌都具有一定的抑制作用，且抑制作用相近。

3 結(jié)論

綜合真菌抑制試驗(yàn)和細(xì)菌抑制試驗(yàn)結(jié)果確定，協(xié)日嘎－4噴霧劑的提取方法應(yīng)該選擇醇提加水提的混合提取方法，而不選擇揮發(fā)油提取部分。

4 討論

循證醫(yī)學(xué)是近十余年來(lái)在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興臨床學(xué)科。其核心思想就是重視證據(jù)。近年來(lái)，有關(guān)在民族醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)行循證醫(yī)學(xué)研究的討論日益引起人們的重視。許多民族醫(yī)藥界人士認(rèn)為，循證醫(yī)學(xué)方法運(yùn)用于民族醫(yī)中藥的研究，有助于促進(jìn)民族醫(yī)藥的現(xiàn)代化，使民族醫(yī)藥的研究能夠得到科學(xué)研究的證據(jù)支持。所以循證研究是民族醫(yī)藥前進(jìn)的必由之路。本課題通過(guò)循證研究為“協(xié)日嘎－4”新劑型的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使蒙藥的應(yīng)用更全面更廣泛，為民族醫(yī)藥的繁榮和發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

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