光照對杜氏鹽藻突變藻株Zea1生長和積累玉米黃素的影響

武昌俊，唐欣昀*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061)

光照對杜氏鹽藻突變藻株Zea1生長和積累玉米黃素的影響

武昌俊1,2，唐欣昀1,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061)

通過紫外線和亞硝基胍(NTG)誘變得到一株杜氏鹽藻高產(chǎn)玉米黃素突變株Zea1，以此突變藻株為實驗材料，通過正交試驗獲得突變藻株生長所需C、N、P的最適濃度分別為15、2.0、0.1mmol/L，積累玉米黃素所需C、N、P的最適濃度分別為15、2.0、0.2mmol/L。分別比較強(qiáng)光照(5000 lx)、正常光照(3000 lx)、低光照(500 lx)對野生型和突變型藻株生長和累積玉米黃素的影響。結(jié)果顯示：在同等光照條件下，突變型藻株藻細(xì)胞數(shù)和玉米黃素的積累都略高于野生型藻株；強(qiáng)光照明顯有利于突變藻株藻細(xì)胞生長和玉米黃素積累，藻細(xì)胞數(shù)分別為低光照和正常光照條件下的7.08倍和1.29倍，玉米黃素含量分別是低光照和正常光照條件下的4.56倍和1.4倍。

杜氏鹽藻；玉米黃素；突變藻株；光照

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)是一種在食品、飼料、醫(yī)藥保健、化工和養(yǎng)殖業(yè)中都有獨特經(jīng)濟(jì)價值的微藻。它是一類能生長在高鹽環(huán)境中的單細(xì)胞綠藻[1]，具有極強(qiáng)的耐鹽性和滲透調(diào)節(jié)能力[2]。杜氏鹽藻體內(nèi)能合成并積累玉米黃素(zeaxanthin，3,3’-二羥基-β-胡蘿卜素，分子式C40H56O2)。玉米黃素是一種天然類胡蘿卜素，屬萜烯類不飽和化合物，常與隱黃素、胡蘿卜素、葉黃素等共存，組成類胡蘿卜素的混合物[3]。玉米黃素具有較強(qiáng)的清除脂質(zhì)過氧化自由基的能力，可作為自由基清除劑[4]。大量研究表明，玉米黃素具有預(yù)防老年性黃斑病變、白內(nèi)障，預(yù)防心血管疾病，抗癌等功效。另外，玉米黃素本身也具有很高的營養(yǎng)價值，食用后可在人體肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化成具有生物活性的VA，對促進(jìn)人體的生長發(fā)育、保護(hù)視力與上皮細(xì)胞、提高抗病能力、延長壽命等具有特殊的功效[5-6]。

然而，玉米黃素作為一種有效的抗氧化劑和高價值的生物產(chǎn)品，目前在商業(yè)上還沒有被廣泛應(yīng)用，主要是由于在正常情況下，它在植物組織中的產(chǎn)量極低。但這一合成途徑可在一些原核生物，如藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)發(fā)生，這就為我們提供了一種在活體內(nèi)通過代謝工程的方法來獲得玉米黃素的新途徑。研究表明，杜氏鹽藻通過誘變，可在藻體內(nèi)大量積累玉米黃素[7]。因此加緊進(jìn)行高產(chǎn)玉米黃素微生物的誘變篩選工作以及后續(xù)探究影響高產(chǎn)玉米黃素突變藻株積累玉米黃素因素的工作，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)藻種由中國科學(xué)院青島海洋研究所提供，經(jīng)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室純化并保存為野生型藻株[8]。

1.2 方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

液體培養(yǎng)：采用Johnsons培養(yǎng)液[9]，對數(shù)期按體積比為1:10的接種量接種培養(yǎng)。光照度為2500～3000 lx，日光燈為光源，光暗比為14h:10h，培養(yǎng)溫度27℃。

固體平板培養(yǎng)： 采用Johnsons培養(yǎng)液加1.0%瓊脂粉，培養(yǎng)條件同上。

細(xì)胞干質(zhì)量的測定：取對數(shù)生長期的藻液200mL，20℃、3000×g離心5min，去上清液，加入14mL 0.3mol/L NaCl溶液懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移到15mL的預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，3000×g離心5min，去上清液，80℃烘干24h，連管一起稱質(zhì)量。重復(fù)上述步驟3次，取平均值計算細(xì)胞干質(zhì)量[7]。

1.2.2 誘變和突變藻株的篩選

紫外線誘變[8]：吸取藻液5mL于無菌培養(yǎng)皿中，在紫外燈下分別照射0、10、20、30、40、50、60s，暗培養(yǎng)48h后稀釋涂平板，光照培養(yǎng)，30d后觀察結(jié)果。

亞硝基胍(NTG)誘變(參考文獻(xiàn)[7]方法略作修改)：取藻液5mL于離心管中，加入NTG溶液，使鹽藻藻液中NTG的最終質(zhì)量濃度為0.001mg/mL，30℃條件下分別振蕩培養(yǎng)0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min，3000×g 離心5min收集藻細(xì)胞，pH7.2磷酸緩沖液清洗，12h暗處理后稀釋涂平板，光照培養(yǎng)，30d后觀察結(jié)果。

挑選呈灰綠色或黃色的藻落，采用1.2.1節(jié)液體培養(yǎng)法培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與野生型藻株一致，測定其玉米黃素含量，并與野生型出發(fā)藻株進(jìn)行比較，證明其是否為高產(chǎn)玉米黃素突變藻株。

1.2.3 玉米黃素含量的測定[7]

將一定質(zhì)量濃度的玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，進(jìn)樣，當(dāng)信噪比等于3時，所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為最低檢測限。分別稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品加到樣品中，進(jìn)行HPLC測定，計算加標(biāo)回收率。在回收率的測定中，重復(fù)3次平行，根據(jù)結(jié)果計算平行性和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[10]。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱定玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品48mg，用少量二氯甲烷溶解，再用丙酮定容為480mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。梯度稀釋，得到480、240、120、60、30、15、7.5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于ˉ20℃作為標(biāo)準(zhǔn)液備用。實驗得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝5.8331χˉ 0.3453，R2＝0.9968)。

玉米黃素的萃取：取2mL藻液，14000r/min離心2min，棄去上清液，加入200μL 經(jīng)過濾的丙酮-甲醇(體積比9:1)溶液，輕輕混勻1min，14000r/min離心2min，取20μL上樣。

HPLC檢測條件：HPLC色譜柱：ZOBAX C18(250mm× 4.6mm，5μm)；流動相：乙腈、二氯甲烷、甲醇(體積比75:20:5，含0.1% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)；檢測壓強(qiáng)130bar；檢測波長：450nm；進(jìn)樣量：20μL；流速：0.8mL/min；柱溫：25℃；檢測系統(tǒng)：Agilent 1100。

1.2.4 碳、氮、磷對突變藻株生長和積累玉米黃素的影響

碳、氮、磷單因素試驗表明10mmol/L葡萄糖對突變藻株生長和積累玉米黃素最佳；1mmol/L (NH4)2SO4效果最好；0.1mmol/L KH2PO4效果最好[11]。所以采用10mmol/L葡萄糖、1mmol/L(NH4)2SO4、0.1mmol/L KH2PO4進(jìn)行正交試驗，測定碳、氮、磷營養(yǎng)元素對鹽藻生長和玉米黃素積累的影響。

1.2.5 光暗培養(yǎng)對突變藻株生長和積累玉米黃素的影響

將生長至對數(shù)期的突變藻株Zea1藻液按體積比為1:10的接種量接種培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基設(shè)計為正交試驗中最適宜積累玉米黃素的最佳培養(yǎng)基，分別在低光照(500 lx)、普通光照(3000 lx)和強(qiáng)光照(5000 lx)條件下培養(yǎng)，每組3個平行，18d后分別取樣測定突變藻株中藻細(xì)胞生長和玉米黃素含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃素含量測定的最低檢測限、回收率和平行性

經(jīng)檢測，r＞0.99，表明線性關(guān)系良好，最低檢測限為0.01μg/g，回收率為96.7%，說明本實驗方法準(zhǔn)確度較高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明本實驗方法平行性較好，實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 玉米黃素含量的測定和誘變結(jié)果

圖1 杜氏鹽藻突變株Zea1中玉米黃素HPLC圖譜Fig.1 HPLC elution profiles of zeaxanthin standard and zeaxanthin from D. salina mutant Zea1

通過NTG誘變后，從平板上挑選灰綠色或/和黃色的藻落，提取其中玉米黃素，采用HPLC法測定其玉米黃素含量(圖1)，并與野生型出發(fā)藻株進(jìn)行比較，得到3株玉米黃素高產(chǎn)突變藻株，其中突變株Zea1中玉米黃素含量最高，為8.97mg/g，野生型玉米黃素含量為3.38mg/g，突變株Zea1中玉米黃素含量是野生型的2.65倍，確定Zea1為實驗藻株。

2.3 碳、氮、磷對突變藻株Zea1藻細(xì)胞生長和積累玉米黃素的影響

表1 正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results

由表1正交試驗結(jié)果可知，碳源對于Zea1藻細(xì)胞生長影響最大，其次是氮源、磷源，所需C的濃度較高，而P的濃度較低，最優(yōu)水平組合是A3B3C1，即C、N、P的濃度分別為15、2.0、0.1mmol/L，此試驗組合不在正交試驗9種組合之內(nèi)，驗證實驗得出A3B3C1組藻細(xì)胞數(shù)為30.15×105個/mL，因此選擇A3B3C1為藻細(xì)胞生長最優(yōu)水平組合。Zea1藻細(xì)胞積累玉米黃素的最主要影響因素是氮源，其次是磷源，碳源的影響最小，所需的C、N濃度都較高，最佳水平組合是A3B3C2，即C、N、P的濃度分別為15、2.0、0.2mmol/L。由此可見，Zea1藻細(xì)胞生長和積累玉米黃素的最適C、N、P的濃度是有差異的，Zea1生長所需的條件和其玉米黃素積累所需條件并不完全相同，因而需要在以后的工作中進(jìn)一步通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，盡可能找到藻生物量和玉米黃素含量的最大組合。

2.4 光照培養(yǎng)對Zea1藻細(xì)胞生長和積累玉米黃素的影響

圖2 不同光照度對野生型和突變型Zeal藻株生長的影響Fig.2 Effect of light intensity on the growth of mutant Zea1 and its parental strain

圖3 不同光照度對野生型和突變型Zeal藻株積累玉米黃素的影響Fig.3 Effect of light intensity on zeaxanthin accumulation of mutant Zea1 and its parental strain

由圖2、3可知，在正交試驗最優(yōu)化培養(yǎng)基條件，即葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4的濃度分別為15、2.0、0.2mmol/L培養(yǎng)，強(qiáng)光照(5000lx)、正常光照(3000lx)、低光照(500lx)對突變型藻株Zea1、野生型藻株生長和累積玉米黃素影響顯著不同。在低光照條件下，突變型藻株Zea1藻細(xì)胞數(shù)和玉米黃素含量分別為野生型藻株的1.22倍和1.21倍；正常光照條件下，Zea1藻細(xì)胞數(shù)和玉米黃素含量分別為野生型藻株的1.21倍和1.02倍；強(qiáng)光照條件下，Zea1藻細(xì)胞數(shù)和玉米黃素含量分別為野生型藻株的1.3倍和1.18倍。說明強(qiáng)光照對野生型藻株和突變型藻株Zea1的生長和玉米黃素的積累都有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，在一定光照范圍內(nèi)，隨著光照的增強(qiáng)，野生型藻株和突變型藻株Zea1藻細(xì)胞分裂和玉米黃素積累都會加強(qiáng)，而且強(qiáng)光照對突變藻株藻細(xì)胞生長和玉米黃素積累作用比正常光照和低光照作用更為明顯，其中，強(qiáng)光照培養(yǎng)下藻細(xì)胞數(shù)分別為正常光照和低光照下的1.29倍和7.08倍，玉米黃素含量分別是正常光照和低光照條件下的1.4倍和4.56倍。

表2 不同光照度對突變型藻株生長和積累玉米黃素影響的顯著性分析(±s，n＝3)Table 2 Significance analysis of the effect of light intensity on the growth and zeaxanthin accumulation of mutant Zea1 and its parental strain (±s，n＝3)

表2 不同光照度對突變型藻株生長和積累玉米黃素影響的顯著性分析(±s，n＝3)Table 2 Significance analysis of the effect of light intensity on the growth and zeaxanthin accumulation of mutant Zea1 and its parental strain (±s，n＝3)

注：a.與正常光照組比較，差異極顯著(P＜0.01)；b.與強(qiáng)光照組比較，差異極顯著(P＜0.01)。

光照度藻細(xì)胞數(shù)/(105個/mL)玉米黃素含量/(mg/g)低光照(500 lx)3.94±0.19ab7.64±0.29ab正常光照(3000 lx)21.62±1.34b24.90±0.40b強(qiáng)光照(5000 lx)27.90±0.6334.87±0.15 F值160.24164.80 P值0.000.00

由表2可知，強(qiáng)光照培養(yǎng)條件下突變型藻株Zea1的藻細(xì)胞數(shù)和積累玉米黃素含量與低光照和正常光照培養(yǎng)下的藻細(xì)胞數(shù)和積累玉米黃素含量比較均有極顯著增加(P＜0.01)。說明在3種光照培養(yǎng)條件下，強(qiáng)光照明顯有利于突變型藻株Zea1藻細(xì)胞生長和玉米黃素積累。一方面可能是由于強(qiáng)光照更有利于突變型藻株Zea1藻細(xì)胞的分裂和生長，從而促進(jìn)藻細(xì)胞大量積累玉米黃素；另一方面可能是因為在鹽藻細(xì)胞內(nèi)存在著一個玉米黃素、環(huán)氧玉米黃素和堇黃素的動態(tài)循環(huán)，強(qiáng)光照可能作為一個外界刺激因子，促使此循環(huán)向玉米黃素合成單向轉(zhuǎn)變，從而促使玉米黃素大量積累[7]。可見在實際大規(guī)模生產(chǎn)中，以最優(yōu)化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)條件，對突變型藻株Zea1進(jìn)行一定強(qiáng)度的光照培養(yǎng)，可以獲得較高的玉米黃素產(chǎn)量。

3 討 論

杜氏鹽藻為耐鹽的單細(xì)胞綠藻，藻體內(nèi)能合成并積累類胡蘿卜素，因此杜氏藻是類胡蘿卜素的良好天然資源，極具開發(fā)應(yīng)用潛力[12]。玉米黃素是一種類胡蘿卜素，平常在植物組織中產(chǎn)量極低。在鹽藻藻細(xì)胞內(nèi)，先由番茄紅素轉(zhuǎn)變成β-胡蘿卜素，而后依次轉(zhuǎn)變成玉米黃素、環(huán)氧玉米黃素和堇黃素，當(dāng)外界條件變化時，玉米黃素、環(huán)氧玉米黃素和堇黃素會形成循環(huán)，是一個動態(tài)的、可逆的、有規(guī)律性的葉黃素反應(yīng)[13]。

目前在玉米黃素實際生產(chǎn)中，大多簡單采用從植物組織中直接提取的方法，此法具有生產(chǎn)周期長，營養(yǎng)消耗大，玉米黃素不易提取等缺點。而鹽藻是一種微藻，具有生長周期短，生長條件寬松，營養(yǎng)消耗低等優(yōu)點，實際大規(guī)模生產(chǎn)中占用空間資源和物資資源較少，是生產(chǎn)玉米黃素的優(yōu)良載體。通過誘變，得到高產(chǎn)玉米黃素突變藻株，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索和優(yōu)化突變藻株的生長和玉米黃素高產(chǎn)的培養(yǎng)條件，是一種在活體內(nèi)通過代謝工程的方法來獲得玉米黃素的新途徑[14]。

本實驗采用紫外線和NTG對野生型杜氏鹽藻進(jìn)行誘變，得到高產(chǎn)玉米黃素突變藻株Zea1。1)外界誘變劑可能阻斷了玉米黃素向環(huán)氧玉米黃素轉(zhuǎn)化的途徑，形成了環(huán)氧玉米黃素向玉米黃素轉(zhuǎn)變的單向途徑，同時也誘使鹽藻細(xì)胞大量積累玉米黃素的代謝前體——β-胡蘿卜素，使其向玉米黃素轉(zhuǎn)化。2)環(huán)氧玉米黃素和玉米黃素的形成是與光合作用中激發(fā)能的消除緊密聯(lián)系在一起的。當(dāng)外界光合強(qiáng)度大于光合飽和劑量時，維管束植物和綠藻的葉綠體就會經(jīng)歷一個可逆的堇黃素次環(huán)氧化作用，形成了環(huán)氧玉米黃素和隨后的玉米黃素，從而導(dǎo)致了玉米黃素在葉綠體類囊體中的積累。催化此反應(yīng)的酶類存在于葉綠體類囊體的內(nèi)腔中[15]，上述兩點因素都在一定程度上增加了玉米黃素的積累。

Eonseon等[7]研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻高產(chǎn)玉米黃素突變株可積累玉米黃素6mg/g，而本實驗誘變得到的Zea1突變株玉米黃素最高產(chǎn)量為(34.87±0.15)mg/g，比其高出約4.8倍。孫麗麗等[16]報道，玉米蛋白粉中玉米黃素最高產(chǎn)量為0.2mg/g，本實驗中，突變株Zea1玉米黃素最高產(chǎn)量約為玉米蛋白粉中玉米黃素含量的174倍?？梢?，本實驗誘變獲得的突變株Zea1積累玉米黃素效果顯著。通過C、N、P正交試驗發(fā)現(xiàn)鹽藻細(xì)胞生長和積累玉米黃素的最適C、N、P的濃度有顯著差異，并得到鹽藻高產(chǎn)玉米黃素突變株Zea1高產(chǎn)玉米黃素的最優(yōu)條件組合。以此組合培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)條件，結(jié)合一定強(qiáng)度的光照進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得較高的玉米黃素產(chǎn)量，為工廠和實驗室大規(guī)模生產(chǎn)玉米黃素提供了可能。

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Effect of Light on the Growth and Zeaxanthin Accumulation of Dunaliella salina Mutant Zea1

WU Chang-jun1,2，TANG Xin-yun1,*
(1.College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2.Anhui Academy of Medical Sciences, Hefei 230061, China)

The optimal concentrations of carbon, nitrogen and phosphate were determined using an orthogonal array design to be 15, 2.0 mmol/L and 0.1 mmol/L for the growth of Dunaliella salina Zea1 and 15, 2.0 mmol/L and 0.2 mmol/L for zeaxanthin accumulation, respectively. The effect of high (5000 lx), normal (3000 lx) and low (500 lx) light intensities on the growth and zeaxanthin accumulation of the mutant strain and its parental strain WD was investigated. Under the same light intensity, the cell number and zeaxanthin accumulation of the mutant strain were both higher than those of the original strain. High light intensity was distinctly beneficial to the growth and zeaxanthin accumulation of the mutant strain and resulted in a 7.08-fold and 1.29-fold increase in cell number and a 4.56-fold and 1.4-fold increase in zeaxanthin content compared with normal and low light intensities, respectively.

Dunaliella salina；zeaxanthin；mutant；light

Q93.33

A

1002-6630(2012)03-0199-04

2011-02-18

安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目(2006KJ173B；2007jq1052)

武昌俊(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為微型藻類生理學(xué)。E-mail：wuchangjun6332364@yahoo.com.cn

*通信作者：唐欣昀(1951—)，男，教授，本科，研究方向為微生物生理學(xué)。E-mail：tangxinyun@21cn.com